裴怀弟，宿兵兵，李玉斌，李淑洁，王立光，李琦，刘新星
摘要：为了给人参果病毒检验及抗病性研究提供支持，对人参果采用ELISA和RT-PCR两种检测方法对8份田间材料中的马铃薯M病毒（PVM）、番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）进行检测，对比筛选病毒检测方法。结果表明，ELISA法检测PVM的阳性检出率为87.5%；
ToMV为37.5%，疑似率为12.5%；
TMV为37.5%。通过RT-PCR检测体系，从人参果样品中分别扩增出与试验设计大小相符的特异条带，PVM阳性检出率为100%，ToMV为 50.0%，TMV为37.5%，检测灵敏性和准确性更高，检测结果符合率在87.5%以上。对扩增阳性产物进行凝胶回收测序，确定为目标条带。
关键词：人参果；
病毒；
ELISA检测；
RT-PCR检测
中图分类号：S662.5 文献标志码：A 文章編号：2097-2172（2023）04-0365-04
doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.04.016
Study on the Detection Methods for Main Viruses of Ginseng Fruit
PEI Huaidi 1， SU Bingbin 1， 2， LI Yubin 3， LI Shujie 1， WANG Liguang 1， LI Qi 1， LIU Xinxing 1
（1. Biotechnology Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. School of Environmental
and Municipal Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）
Abstract：
To provide references for virus testing and disease resistance research in ginseng fruit （Solanum muricatum Aiton），8 materials of ginseng fruit were tested from the fields by using ELISA and RT-PCR methods to detect potato virus M（PVM）， tomato mosaic virus （ToMV） and tobacco mosaic virus （TMV）， and comparison and screening of virus detection methods were conducted. The results showed that by using the ELISA method， the positive detection rates of PVM and ToMV were 87.5% and 37.5%， respectively，suspicion rate was 12.5%， and the positive rate of TVM was 37.5%. By using the RT-PCR detection system， specific bands were amplified from ginseng fruit samples which were consistent with the size of the test design， the positive detection rates of PVM， ToMV and TMV were 100%， 50.0% and 37.5%， respectively， which indicated better detection sensitivity and accuracy， the coincident rate of the detected results was more than 87.5%. The amplified positive product was sequenced by gel recovery and was identified as the target band.
Key words：
Solanum muricatum Aiton; Virus; ELISA test; RT-PCR test
人参果（Solanum muricatum Ait.）又名香瓜茄、长寿果、凤果等，为茄科茄属多年生草本植物，原产于南美洲安第斯山脉北麓［1 - 2 ］，自20世纪80年代引入中国，在我国多地均有种植。生产过程中人参果通常采用扦插繁殖育苗，长期无性繁殖造成人参果病毒病的感染和蔓延，主要表现为植株矮化、节间变短、叶片皱缩呈黄绿相嵌的斑驳状、果实僵化畸形等，对作物产量及品质影响巨大。培育无病毒种苗是预防病毒病的有效措施，同时对病毒的防控、无毒苗生产及海关检疫等方面显得尤为必要［3 ］。目前，关于人参果的研究主要集中在组培快繁［4 - 7 ］、温室栽培 及基因组学等方面［8 - 13 ］，而关于病毒的种类、鉴定及高效检测研究相对较少。我们采用双抗体夹心ELISA和RT-PCR两种检测方法，对人参果植株主要病毒进行分析，以期为人参果病毒检验及抗病性研究提供支持。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为人参果组培苗，共8份，培养材料为人参果侧芽，采自甘肃省武威市民勤县双茨科镇农户温室大棚，由甘肃省农业科学院生物技术研究所培育并提供，实验所用试剂均为化学分析纯。
1.2 试验方法
将大田采集的人参果侧芽用流水冲洗3～4 h，控干水分，在超净工作台上用无菌水洗3～5遍，用70%乙醇消毒30～40 s，投入1 g/kg升汞溶液中消毒5～6 min，再用无菌水洗5～6次，置于垫有滤纸的培养皿中晾干水分后接种于MS培养基（添加30 g/L蔗糖）中，pH为5.8～6.0。在温度（25±2） ℃、光照12～16 h，光照强度2 000～3 000 lx条件下培养，每隔25 d左右进行转接，获得无菌苗备用。
1.2.1 引物的设计 根据GenBank数据库上已公布的PVM 、TMV、ToMV的RNA序列，对PVM（NC_001361.2）、ToMV（NC_002692.1）和TMV（NC_ 001367.1）序列进行BLAST（basic local alignment search tool）相似性比较，找出3种病毒RNA的高度特异性区域，设计试验所用引物。所用引物均由上海生工生物技术有限公司设计、合成，引物序列信息见表1。
1.2.2 RNA提取 采用TIAN GEN RNAprep pure Plant Kit（DP432）提取人参果叶片总RNA。取50～100 mg植物叶片，在液氮中迅速研磨成粉，加入450 μL裂解液RL，旋涡剧烈震荡混匀。其他步骤按说明书操作。将提取的总RNA溶解于50 μL的ddH2O中备用。
1.2.3 RT-PCR检测 采用TIAN GEN FastKinggDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒（KR118- 02），以总RNA为模板，逆转录合成cDNA第1链，然后在MiniAmp Thermal Cycler仪上进行PCR扩增。扩增体系为将cDNA 1 μL加入14 μLRT-PCR反应液中，混匀后放入仪器中进行扩增。扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；
72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.4 RT-PCR产物回收与测序 取扩增产物25 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，各条带充分分离时切取胶进行纯化。PCR产物纯化步骤按TIANgel Purification Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明进行，回收产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.5 双抗体夹心ELISA检测 取0.2 g人参果叶片置于研钵中，加1.5 mL提取缓冲液，研磨成匀浆后转移到2 mL离心管中，摇匀；
4 ℃、12 000 r/min下离心5 min，将上清液转移到干净的离心管中，置-20 ℃保存备用。ELISA检测所用试剂盒购自Agdia公司（产品编号：PSA60000），测定方法按抗体说明书进行。在试验条件恒定的情况下，利用标本/阴性对照的比值进行分析。根据测定所得的吸光度求出被测样品光密度值（P）与标样（健康材料）光密度值（N）比值（P/N）。结果判定：P/N＜1.50者，为阴性（不带毒材料）；
P/N介于1.50～1.99者，为疑似（轻度带毒材料）；
P/N≥2.00者，为阳性（带毒材料）。
2 结果与分析
2.1 ELISA检测
利用双抗体夹心ELISA 对人参果主要病毒进行检测，结果（表2）表明，人参果中含有马铃薯M病毒（PVM）、番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）病毒。检测数据显示，PVM的阳性检出率为87.5%；
ToMV的阳性检出率为37.5%，疑似率为12.5%；
TMV的阳性检出率为37.5%。上述结果表明，田间种植的人参果中普遍含有马铃薯M病毒，为最主要病毒，其次为番茄花叶病毒和烟草花叶病毒。
2.2 RT-PCR检测
以人参果总RNA为模板，经RT-PCR扩增后，3种病毒的感病植株在琼脂糖凝胶上分别呈现出与目标片段大小相一致的反应谱带。如图1所示，扩增后得到了分子量分别为261 bp（PVM）、365 bp（ToMV）、 343 bp（TMV）的片段，且該片段与理论设计长度相一致。测定结果表明，PVM的阳性检出率为100%。ToMV的阳性检出率为50.0%，TMV的阳性检出率为37.5%。
2.3 基因序列同源性比对
随机抽取人参果3种病毒cDNA扩增检测为阳性的样本各3份进行凝胶回收纯化，对回收产物进行测序（图2）。测序结果经与NCBI报道的3种病毒的基因序列相比同源性很高，阳性标本基因序列比对结果：PVM同源性为94.25%，ToMV为100%，TMV为81.34%，说明3种病毒引物在人参果中所提取的RNA中扩增出的基因片段为PVM、ToMV和TMV的目标片段。
2.4 两种检测方法对比
对8份人参果材料用两种方法检测的结果进行比较，结果（表3）表明，2种检测方法有较高的符合率，RT-PCR检测效率和准确性更高，ELISA检测为疑似的植株通过RT-PCR检测则为阳性，避免了假阴性的出现，检测灵敏性更高。二者检测符合率在87.5%以上。
3 讨论与结论
植物病毒检测常用的方法中有生物学、电子显微观察法、血清学和分子生物学等［14 - 15 ］，实际操作中多采用两种以上方法相结合来判断检测结果的准确性。酶联免疫吸附法（ELISA）测定方便、灵敏度较高，但只能检测到纳克水平的病毒，难于检测更低浓度的病毒［16 ］；
聚合酶链反应技术（PCR）是分子生物学中最常见的检测方法之一，通过体外扩增的方法对供试样品中的目的基因片段进行扩增，从而对即使病毒含量极低的样品也能灵敏准确地得到定性的检测结果，其灵敏度和特异性较高，是一种较好的植物病毒检测方法［17 ］。
本试验采用两种方法检测的结果表明，田间种植的人参果普遍含有马铃薯M病毒，为最主要的病毒，其次为番茄花叶病毒和烟草花叶病毒。ELISA检测中PVM的阳性检出率为87.5%；
ToMV为37.5%，疑似率为12.5%；
TMV为37.5%。试验建立的RT-PCR检测体系，从人参果样品中分别扩增出与试验设计大小相符的特异条带，结果显示，PVM阳性检出率为100%，ToMV为 50.0%，TMV为37.5%，这在基因水平上为马铃薯M病毒、番茄花叶病毒和烟草花叶病毒的检测提供了更快速、灵敏检测手段，避免了假阴性的出现，且检测结果符合率在87.5%以上。
参考文献：
［1］ 王福国，黄少学. 高海拔冷凉地区日光温室人参果栽培技术［J］. 农业科技与信息，2008（15）：23-24.
［2］ 王泽东，雷成军，万柔旦才让. 高寒山区日光温室人参果组培苗驯化扩繁技术［J］. 甘肃农业科技，2020（7）：92-94.
［3］ 袁志豪，李振峰，陆月霞，等. 百合病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测［J］. 华中农业大学学报，2022，41（3）：157-163.
［4］ 陆瑞菊，王亦菲，周润梅，等. 人参果的脱毒与快速繁殖［J］. 中国农学通报，2001，17（２）：4-7.
［5］ 刘兴成，王文庆. 人参果组培快繁培养基的筛选研究［J］. 甘肃农业科技，2009（10）：17-19.
［6］ 张俊伟，郭盘江，陈冠吉. 人参果组织培养技术研究［J］. 西南林学院学报，2003，23（2）：21-22.
［7］ 张菲菲，张金文，石 菁. 人参果茎尖分生组织试管苗再生体系的建立与优化［J］. 草原与草坪，2013，33（4）：34-38.
［8］ 刘开琳，刘虎俊，刘淑娟，等. 干旱区日光温室人参果栽培技术——以民勤县双茨科镇日光温室为例［J］. 农业科技与信息，2020，20（601）：93-95.
［9］ 刘建光. 沙漠地区日光温室人参果栽培技术研究［J］. 农业技术与装备，2021（5）：163-164.
［10］ 陈姝欣，朱浩东，杨梦思，等. 基于人参果转录组测序的SSR和SNP特征分析［J］. 西南农业学报，2020，33（11）：2412-2416.
［11］ 高宜峰，张菲菲，张金文，等. TMV、PVM 和CMV 干扰载体构建及对人参果遗传转化［J］. 核农学报，2014，28（1）：44-51.
［12］ 郑红英，陈 炯，陈剑平. 侵染人参果的马铃薯M病毒基因组全序列分析［J］. 微生物学报，2003，43（3）：336-341.
［13］ 王克婧，张金文，张菲菲，等. 重组des-pGlu1-Brazzein基因植物表达载体的构建及对人参果的遗传转化［J］. 分子植物育种，2016，14（6）：1470-1481.
［14］ 蒋 康，罗俊杰，王红梅，等. 人参果种苗脱毒与病毒检测技术研究进展［J］. 农业工程，2020，10（11）：102-106.
［15］ 迟惠荣，毛碧增. 植物病毒检测及脱毒方法的研究进展［J］. 生物技术通报，2017，33（8）：26-33.
［16］ XU P S， NIIMI Y. Evaluation of virus-free bulbet pro-duction by antiviral and/or heat treatment in vitroscale cultures of Lilium longiflorum Georgia and L. Casablanca［J］. J Jpn Soc Hort Sci， 1999（68）：
640-647.
［17］ 马 筠． 植物病毒鑒定检测方法的研究进展［J］. 世界农业，2003，25（8）：50-51.
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