杨宇珂 刘良裕 崔秀梅 顾 选 王建农 付建华*
三银芪丹颗粒是由黄芪、丹参、三七、当归、银杏叶等中药经加工制成的颗粒剂，具有益气活血的功效，适用于中风、恢复期属气虚血瘀证患者的康复和辅助治疗，症见半身不遂、舌强语蹇、气乏力短、自汗等。目前，根据原国家食品药品监督管理局相关标准，采用薄层色谱法（TLC）鉴别，对三银芪丹颗粒中黄芪、丹参和三七进行质量控制，采用高效液相色谱法（HPLC）对黄芪中黄芪甲苷含量进行控制。但上述质量控制方法存在方法较为简单，专属性不强的问题，无法全面反映和控制三银芪丹颗粒的质量。故本研究针对现行质量标准WS-5066（B-0066）-2014Z 中的鉴别项目进行验证，同时建立鉴别丹参药材中丹参素钠的TLC 及测定丹参素钠含量的HPLC，为三银芪丹颗粒质量标准的完善及提升提供依据。
1.1 仪器与试药
Agilent 1200、1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；
AUW220D 型万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；
XZ-6DTD 型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂，规格为10 cm×10 cm、10 cm×20 cm）。
三银芪丹颗粒（华颐药业有限公司，批号为190101、190102、190103）；
丹参素钠对照品（批号为110855-201614），人参皂苷Re 对照品（批号为110754-200320），人参皂苷Rg1 对照品（批号为110703-200322），人参皂苷Rb1 对照品（批号为110704-200318），均购自中国食品药品检定研究院；
三七皂苷R1 对照品（批号为P27J9F64476）购自上海源叶生物科技有限公司；
甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 丹参的TLC 鉴别取本品0.5 g，加水1 ml，盐酸2 滴，振摇溶解，加乙酸乙酯3 ml，萃取，分层完全后取上层过滤，即得供试品溶液。另取丹参素钠标准品，加入75%甲醇制得1.0 mg/ml 的丹参素钠标准品溶液。取丹参阴性样品0.8 g 干膏粉（相当于颗粒1 g），加水2 ml 和稀盐酸3～4 滴振摇使溶解，加入乙酸乙酯6 ml，萃取，分层后取上清液，即为丹参阴性样品溶液。参考TLC（中华人民共和国药典2015 版四部0502 通则）试验，在同一硅胶G 板上，分别吸取10 μl 供试品溶液和2 μl 标准品溶液进行点样。展开剂选择三氯甲烷-丙酮-甲酸（25∶10∶4）进行展开，展开后取出，并晾干。将薄层板置于氨蒸汽中，氨熏15 min，放置30 min 后，于紫外光（365 nm）下检视。
1.2.2 三七的TLC 鉴别取本品2 g，研细，加至具塞锥形瓶中，用50 ml 甲醇进行溶解，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20 ml 使溶解，转移至分液漏斗中，用20 ml 乙醚振摇提取，重复2 次，再用20 ml 水饱和正丁醇振摇提取，重复3 次，合并正丁醇提取液，用20 ml 氨试液洗涤，重复2 次，再用20 ml 正丁醇饱和的水洗涤，重复2 次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 ml 使溶解，即得供试品溶液。另取人参皂苷Rb1 对照品、人参皂苷Re 对照品、人参皂苷Rg1 对照品和三七皂苷R1 对照品，加入甲醇制得各成分浓度均为0.5 mg/ml 的混合对照品溶液。按处方工艺制备缺三七药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法得到阴性对照溶液。参考薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502 通则）试验，在同一硅胶G 薄层板上，分别吸取5 μl 供试品溶液、混合对照品溶液和阴性对照溶液进行点样，展开剂选择三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液，放置于10 ℃以下进行展开，展距15 cm，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液作为显色剂，于105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。
1.2.3 丹参素钠含量测定
1.2.3 .1 色谱条件与系统适应性试验色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm）；
流动相：甲醇-1%醋酸水溶液（3∶97）；
流速：1 ml/min；
检测波长：280 nm；
柱温：35 ℃；
进样量：5 μl。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3 000。
1.2.3 .2 溶液制备精密称定丹参素钠对照品粉末，加50%甲醇制成40 μg/ml 的丹参素钠溶液，即得对照品溶液。取装量差异项下的本品，混匀，研细，取约3 g，精密称定后，置具塞锥形瓶中，精密加入25 ml 的50%甲醇，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷后，再次精密称定，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液。取方中去除丹参的各药味，按处方比例及制备工艺制得阴性样品，取该阴性样品，制备方法同供试品溶液一致，制得阴性对照品溶液。
1.2.3 .3 方法学考察1）专属性考察：分别进样测定丹参素钠对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，并记录色谱图。2）线性关系考察：精密吸取已配制好的丹参素钠对照品贮备液0.5、1、2、3、4、8 ml 于5 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，按“1.2.3.1”项下色谱条件进行进样和测定，以对照品溶液浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）计算线性回归方程。3）精密度试验：精密吸取供试品溶液（批号190102），按“1.2.3.1”项下色谱条件，连续进样6 次，分别记录丹参素钠色谱峰面积。4）重复性试验：取同一批号（190102）的三银芪丹颗粒6 份，按“1.2.3.2”项下供试品溶液制备方法，新制的6 份供试品溶液，按“1.2.3.1”项下色谱条件分别进样测定，计算6 份供试品溶液中丹参素钠的含量，并计算平均值及相应的相对标准偏差（RSD）值。5）重现性试验：不同实验室、不同仪器、不同分析人员下，按“1.2.3.1”项下色谱条件，精密吸取已配制好的供试品溶液（批号190102），连续进样6 次，分别记录丹参素钠的色谱峰面积。6）稳定性试验：将已配制好的供试品溶液（批号为190102），于室温放置，在制备后0、2、4、6、8、10 和12 h 时，按“1.2.3.1”项下色谱条件，精密吸取5 μl，注入高效液相色谱仪，记录丹参素钠的色谱峰面积。7）加样回收试验：精密称取同一批已知含量的三银芪丹颗粒（批号为190102，丹参素钠含量1.09 mg/g）1 g，6 份，各组再加入丹参素钠对照品溶液（前期配制时标准品储备液浓度为0.2 mg/ml）5 ml，依法制得供试品溶液。再按外标一点法测定，计算丹参素钠的加样回收率。
1.2.3 .4 含量测定采用HPLC 测定公司生产的3 批（190101、190102、190103）三银芪丹颗粒的丹参素钠含量。
2.1 丹参的TLC 鉴别
供试品在和对照品相应位置的薄层色谱上，显示相同颜色斑点，阴性对照无相应颜色斑点。见图1A。
2.2 三七的TLC 鉴别
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色斑点，阴性对照无相应颜色斑点。见图1B。
图1 薄层色谱
2.3 丹参素钠含量测定
2.3.1 方法学考察1）专属性考察：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间内出现丹参素钠色谱峰，而丹参阴性对照品溶液色谱图在丹参素钠的位置无吸收峰，表明方法专属性良好。见图2。
图2 高效液相色谱
2）线性关系考察：回归方程Y= 6.648 2X+5.341 1（R2=0.999 9）。表明在20～200 μg/ml 的浓度范围内丹参素钠线性关系良好。3）精密度试验：结果显示丹参素钠RSD 值为2.14%（n=6），表明仪器精密度良好。4）重复性试验：结果表明，丹参素钠平均含量为1.09 mg/g，RSD 值为1.66%（n=6），说明方法重复性良好。5）重现性试验：计算RSD 值为3.15%（n=6），表明该方法重现性良好。6）稳定性试验：计算RSD 值为2.75%（n=6），表明本实验条件下12 h内测定，样品稳定性良好。7）加样回收试验：计算平均回收率为103.28%，RSD 值为1.59%（n=6），表明该方法回收率良好。见表1。
表1 三银芪丹颗粒加样回收率试验结果
2.3.2 含量测定结果表明，3 批样品中丹参素钠含量均高于1.0 mg/g，样品检验结果符合规定。见表2。
表2 样品含量测定结果
中药制剂由于药材成分复杂，有效成分不明确，制备工艺繁琐且剂型丰富，使其在质量控制上受到较多限制[1]。本品原质量标准中选择原儿茶醛作为丹参的薄层鉴别指标成分，然而前期实验发现在储存期间，原儿茶醛含量不稳定，采用TLC 难以检测到斑点且专属性较差，且受展开剂组成影响易导致假阴性现象，故考虑选择丹参中活血化瘀有效成分丹参酮ⅡA、丹酚酸B、丹参素钠作为薄层检测指标成分[2-3]。通过前期文献调研和条件摸索，同时参考三银芪丹颗粒的水提醇沉提取工艺发现，由于丹参酮ⅡA 为脂溶性成分，丹酚酸B 虽为水溶性成分但热不稳定，故两者在薄层鉴别中均未发现目标成分，最终选择丹参素钠为对照品进行薄层鉴别和含量测定[4-6]。此外，在前期的预实验中，银杏叶的TLC 鉴别参照2015 版《中华人民共和国药典》[7]中方法，标品斑点清晰，但样品斑点未能与标品完全对应，改变取样量及供试品制备方法均无法改善实验现象，故未列入正文。
在考察丹参TLC 鉴别方法时，分别对点样量、薄层板品牌、展开剂比例、氨气熏蒸时间是否影响样品斑点进行实验，结果显示本研究所建立方法具有特征斑点清晰，分离度好，耐用性强，成熟可靠的特点。
丹参素钠是丹参发挥活血化瘀、理气止痛药效的主要成分之一[8]。在流动相选择时，文献多采用乙腈（甲醇）-磷酸（醋酸）-水系统[9-10]。经前期实验对比考察，最终选出分离效果好、保留时间适中的甲醇-1%醋酸水溶液系统作为流动相。对提取溶剂（水、30%甲醇、50%甲醇）和提取时间（10、20、30 min）进行筛选时，发现提取溶剂对丹参素钠的测定无显著影响，而提取时间在较短时刻样品溶解不充分，故最终选择提取条件为50%甲醇作为提取溶剂，提取时间为30 min。同时还考察不同流动相比例（2∶98、3∶97、4∶96）、不同色谱柱（资生堂SPOLAR 柱、资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱、资生堂SUPERRIOREX ODS 柱）、不同柱温（30、35、40 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）、不同检测波长（275、280、285 nm）对于丹参素钠含量测定的影响，结果各色谱条件下，柱温、流速及波长的变化对测量结果无干扰，而流动相比例则应控制为甲醇-1%醋酸水（3∶97），色谱柱则应选择CAPCELL PAK C18柱，表明该方法耐用性较好。
在吸收波长的选择上，在波长210～400 nm 范围内扫描，结果显示丹参素钠在280 nm 处出峰完全，有最大吸收，故选择280 nm 作为检测波长。
综上所述，在三银芪丹颗粒现行质量标准基础上，对丹参的TLC 鉴别项进行了修订和完善，并建立了有效成分指标丹参素钠的含量测定。本研究建立的方法专属性强，重复性、精密度、稳定性均较好，且简单易行，质量可控，为完善和提升三银芪丹颗粒质量标准提供了依据。
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