汪 博，张明焕
武汉市第三医院 武汉大学附属同仁医院 1.麻醉科；
2.骨科，湖北 武汉 430071
骨关节炎(osteoarthritis)是最常见的与年龄相关的慢性和致残性关节疾病[1]。然而，骨关节炎的确切发病机制尚未阐明。软骨细胞是正常软骨的唯一细胞成分，软骨细胞损伤与骨关节炎进展相关，包括软骨细胞凋亡、炎性损伤和氧化应激[2]。最近的研究表明，骨关节炎的发病机制与非编码RNA相关[3]circRNA可以像海绵一样与miRNA结合，干扰它们的表达，从而干扰下游的mRNA或蛋白质[4]。类风湿性关节炎患者外周血中的CIRC_0044235显著降低，可能通过与miR-892a相互作用而在类风湿性关节炎中发挥作用[5]。miR-574-5p是一种在骨关节炎软骨细胞中高表达的miRNA[6]。但CIRC_0044235对骨关节炎的影响及其机制是否涉及miR-574-5p仍不清楚。基于此，本研究使用白细胞介素(interleukin，IL)-1β诱导软骨细胞建立骨关节炎的体外模型，分析软骨细胞中CIRC_0044235与miR-574-5p的调控网络。
1.1 材料
人关节软骨细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司);Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；
PrimeScript RT、SYBR Premix Ex Ta Ⅱ试剂盒(TaKaRa Bio公司)；
miR-574-5p模拟物、模拟物对照miR-NC、pcDNA、pcDNA-CIRC_0044235、miR-574-5p抑制物anti-miR-574-5p和抑制物对照anti-miR-NC(Gene Pharma公司)；
超氧化物歧化酶(super-oxide orgotein dismutase，SOD)检测试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrofenase，LDH)检测试剂盒、IL-6酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosor-bent assay，ELISA)试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒、RIPA裂解缓冲液、BCA试剂盒和膜联蛋白V(annexin V)-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；
ECL化学发光溶液(北京Solarbio公司)；
抗B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗体和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体(Abcam公司)；
pmirGLO载体和荧光素酶检测试剂盒(Promega公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养与处理：软骨细胞在含10%胎牛血清+1%双抗的DMEM培养液中培养，并维持在37 ℃和5% CO2环境中增殖。将软骨细胞分为对照组、IL-1β组(10 μg/L的IL-1β处理软骨细胞2 h[7])、分别转染pcDNA、pcDNA-CIRC_0044235、anti-miR-NC、anti-miR-574-5p、pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC、pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p，干预IL-1β。
1.2.2 RT-qPCR检测CIRC_0044235和miR-574-5p表达：用Trizol试剂提取软骨细胞总RNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度计评估RNA的浓度和质量。使用PrimeScript RT试剂盒通过反转录获得cDNA。使用SYBR Premix Ex Ta Ⅱ在ABI 7500实时PCR系统上确定CIRC_0044235和miR-574-5p的相对表达。引物序列(5′-3′)如下：CIRC_0044235 F：TGAGTTTGGTGATTCAGCTTGC，R：AACAAGG CTTCTTCTGAGTGT；
β-肌动蛋白(β-actin) F：TAC TGCCCTGGCTCCTAGCA，R：TGGACAGTGAGGCCA GGATAG。miR-574-5p F：CGCGTGAGTGTGTGTGT GTGA，R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；
U6F：CTC GCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGC GT；
β-actin和U6用作内部对照，使用2-△△Ct方法分析CIRC_0044235和miR-574-5p的相对表达。
1.2.3 流式细胞测量术检测细胞凋亡：根据annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒随附操作说明，每组软骨细胞在避光处与5×10-6L annexin V-FITC和5×10-6L碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合，保持15 min。在FACSCalibur流式细胞仪上分析凋亡率。
1.2.4 Western blot检测Bax和Bcl-2表达：用含有蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解缓冲液提取软骨细胞总蛋白；
BCA试剂盒对总蛋白进行定量，并经SDS-PAGE分离。继而，将蛋白转移到PVDF膜上。将膜与1∶1 000稀释的一抗(抗-Bax、-Bcl-2和-GAPDH抗体)一起孵育，然后与二抗(羊抗兔IgG)一起孵育。将ECL化学发光溶液和ChemiDoc凝胶成像系统应用于条带可视化，内参为GAPDH。
1.2.5 生化指标的检测：比色法检测每组软骨细胞培养液中SOD和LDH活力，ELISA检测每组软骨细胞培养液中IL-6和IL-10水平，具体步骤按照SOD、LDH、IL-6与IL-10试剂盒说明书进行。
1.2.6 双荧光素酶报告实验检测CIRC_0044235和miR-574-5p的靶向结合：预测软件Circutar RNA Interactome用于筛选与CIRC_0044235结合的靶miRNA。创建CIRC_0044235的野生型(WT)和突变(MUT)序列，将其克隆到pmirGLO载体中，合成WT-CIRC_0044235与MUT-CIRC_0044235，并与miR-574-5p模拟物或模拟物对照miR-NC共转染到软骨细胞中以检查CIRC_0044235和miR-574-5p之间的关系。最后，通过荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。
1.3 统计学分析
2.1 各组细胞中CIRC_0044235和miR-574-5p的表达水平比较
与对照组比较，IL-1β组CIRC_0044235表达量降低(P<0.05)，miR-574-5p表达量升高(P<0.05)；
与IL-1β组、IL-1β+pcDNA比较，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235组CIRC_0044235表达量升高(P<0.05)，miR-574-5p表达量降低(P<0.05)；
与IL-1β+anti-miR-NC组比较，IL-1β+anti-miR-574-5p组miR-574-5p表达量降低(P<0.05)；
与IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC组比较，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p组miR-574-5p表达量升高(P<0.05)(图1)。
*P<0.05 compared with control group；
#P<0.05 compared with IL-1β group；
&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；
△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；
▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group
2.2 各组细胞凋亡的比较
与对照组相比，IL-1β组凋亡率升高(P<0.05)；
与IL-1β组或IL-1β+pcDNA组相比， IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235组凋亡率降低(P<0.05)；
与IL-1β+anti-miR-NC组相比，IL-1β+anti-miR-574-5p组凋亡率降低(P<0.05)；
与IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC组相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p组凋亡率升高(P<0.05)(图2)。
*P<0.05 compared with con group；
#P<0.05 compared with IL-1β group；
&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；
△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；
▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group
2.3 各组细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达
与对照组相比，IL-1β组Bax蛋白表达量升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05)；
与IL-1β组或IL-1β+pcDNA组相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235组Bax蛋白表达量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量升高(P<0.05)；
与IL-1β+anti-miR-NC组相比，IL-1β+anti-miR-574-5p组Bax蛋白表达量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量升高(P<0.05)；
与IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC组相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p组Bax蛋白表达量升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05)(图3)。
*P<0.05 compared with control group；
#P<0.05 compared with IL-1β group；
&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；
△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；
▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group
2.4 各组细胞的生化指标比较
与对照组相比，IL-1β组SOD活力、IL-10含量降低(P<0.05)，LDH活力、IL-6含量升高(P<0.05)；
与IL-1β组或IL-1β+pcDNA组相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235组LDH活力、IL-6含量降低(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量升高(P<0.05)；
与IL-1β+anti-miR-NC组相比，IL-1β+anti-miR-574-5p组LDH活力、IL-6含量降低(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量升高(P<0.05)；
与IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC组相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p组LDH活力、IL-6含量升高(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量降低(P<0.05)(图4)。
*P<0.05 compared with control group；
#P<0.05 compared with IL-1β group；
&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；
△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；
▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group
2.5 CIRC_0044235靶向调控miR-574-5p
Circutar RNA Interactome预测到CIRC_0044235和miR-574-5p部分序列可以互补配对，含有二者结合位点的WT-CIRC_0044235和MUT-CIRC_0044235序列(图5)。miR-574-5p组转染WT-CIRC_0044235软骨细胞的荧光素酶活性比miR-NC组降低约52.53%(P<0.05)，miR-574-5p组、miR-NC组转染MUT-CIRC_0044235软骨细胞的荧光素酶活性的变化无统计学意义(图6)。
图5 CIRC_0044235和miR-574-5p的互补序列
* P<0.05 compared with miR-NC
先前的两项研究表明，来自系统性红斑狼疮患者的外周血单核细胞中CIRC_0044235表达减少[8]，CIRC_0044235在类风湿性关节炎患者中表达被抑制[9]，可能作为系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的诊断生物标志物， 具有重要的临床价值。同样，本研究发现IL-1β诱导的软骨细胞中CIRC_0044235表达减少，这意味着CIRC_0044235可能参与了IL-1β引起的软骨细胞损伤。细胞凋亡是发育过程中细胞死亡的一个活跃过程，软骨细胞凋亡与软骨退化有关，可能导致骨关节炎中关节软骨的衰竭[10]。软骨细胞凋亡受细胞因子和一系列信号通路(涉及BAX和Bcl-2)的调控[11]。本研究发现过表达CIRC_0044235减轻了IL-1β引起的软骨细胞凋亡，并伴随BCL-2上调与BAX下调。炎症在骨关节炎发病机制中起关键作用[12]。通过检测促炎细胞因子(IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10)[13]的表达，本研究证实过表达CIRC_0044235减弱了IL-1β诱导的炎性损伤。氧化应激是骨关节炎的另一个关键因素[14]。本研究中，软骨细胞氧化应激由IL-1β引起，通过减弱SOD活力，以及增强LDH活力。此外，过表达CIRC_0044235减弱了这种伤害。根据这些结果，CIRC_0044235可能在减轻骨关节炎中软骨细胞损伤的过程中起关键作用，CIRC_0044235可以防止IL-1β引起的软骨细胞损伤，这与CIRC_0044235减轻类风湿性关节炎炎性反应、 细胞凋亡和关节损伤的报道[5]类似，表明CIRC_0044235可能作为调节骨关节炎中软骨细胞损伤的治疗靶点。
研究表明，骨关节炎小鼠膝关节和IL-1β诱导的软骨细胞中miR-574-5p水平升高，下调miR-574-5p表达是隐丹参酮保护骨关节炎的重要机制[6]。有人在类风湿性关节炎中检测到高丰度的miR-574-5p[15]。同样，本研究在IL-1β诱导的软骨细胞中也发现了高表达的miR-574-5p。此外，抑制miR-574-5p减弱了IL-1β引起的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎性损伤，表明miR-574-5p在IL-1β诱导的骨关节炎损伤中具有促进作用。本研究验证了CIRC_0044235靶向调控miR-574-5p，并且miR-574-5p模拟物可以减轻CIRC_0044235对IL-1β诱导的软骨细胞损伤。表明CIRC_0044235通过海绵miR-574-5p调节IL-1β诱导的软骨细胞损伤。
总之，CIRC_0044235通过靶向miR-574-5p减轻IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎性反应。本研究提出骨关节炎软骨细胞损伤发病机制的新见解，并表明CIRC_0044235和miR-574-5p可能作为骨关节炎治疗的新靶点。
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