刘 丽 彭茂民 夏 虹 彭西甜 彭立军
（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农产品营养品质与安全湖北省重点实验室，武汉 430064）
苯并［a］芘，是含苯环的稠环芳烃，被国际癌症研究机构 （International Agency for Research on Cancer，IARC）列为I类致癌物。世界各国或国际组织对食品中苯并［a］芘的残留量进行了非常严格的限制，制定了苯并［a］芘的限量标准，如我国于2017年3月17日发布的国家标准GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定油脂及其制品中苯并［a］芘的最大残留限量为10μg/kg；
欧盟于2020年9月9日发布（EU）2020/1255文件，规定食品中苯并［a］芘最高限量为10μg/kg。苯并［a］芘的检测是食品质量安全监管的重点工作[1～3]，目前常用于检测苯并［a］芘的方法包括色谱法、光谱法和免疫分析法等[4～6]。其中，光谱法是基于苯并［a］芘分子结构信息，可实现实时、原位探测，且数据处理简单，灵敏度、准确率高，能满足现场快速检测的需求，但是由于样品成分复杂，光谱法缺乏对样品的分离、富集能力，选择性较差[7]。
钙钛矿是一类具有ABX3结构类型的晶体材料的统称，其中A是较大的阳离子，如Cs+、Rb+CH3NH3+（MA）、CH3CH2NH3+（FA）等；
B是较小的阳离子，如Pb2+、Sn2+、Ti4+、Ge2+等；
X是卤素阴离子I-、Br-、Cl-。钙钛矿量子点（Pervoskite quantum dots，PQDs）的合成方法简单、荧光量子产率高、发光纯度高，这些优异的光学性能使其在荧光传感领域具有潜在的应用前景[8]。但是，将钙钛矿量子点用于荧光传感领域的报道并不多[9～11]。钙钛矿量子点具有强离子性、高表面能及表面配体易迁移等特性，但对环境高度敏感，需要多配体协同作用才能实现对各种表面缺陷态的有效钝化从而控制其稳定性和光学性能，且钙钛矿量子点自身并不具备选择性分析的能力。通过一定的修饰方法提高钙钛矿量子点的稳定性和选择性是其在荧光传感领域应用的关键。
分子印迹是在仿生科学即模拟自然界中酶-底物及受体-抗体作用的基础上发展而来的一项技术[12]。选择具有合适官能团的前驱体制备相应的分子印迹聚合 物 （Molecularly imprinted polymer，MIP）并与钙钛矿量子点结合，不仅能实现对目标分子的选择性吸附，更能对钙钛矿量子点表面进行钝化和缺陷抑制，同时提升钙钛矿量子点的稳定性。本文拟将分子印迹技术与传感技术结合，建立一种基于MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的苯并［a］芘检测方法。
（一）仪器与试剂溴化甲基铵（MABr，纯度99.9%），默克化工技术（上海）有限公司；
溴化铅 （PbBr2， 纯度99.0%）、 正 硅 酸四乙 酯（TEOS）、苯并［a］芘（BaP），阿拉丁试剂（上海）有限公司；
油酸（OA，纯度90%）、二氯甲烷（DCM）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，纯度99%），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；
N，N-二甲基甲酰胺（DMF，纯度≥99.9%）、甲苯（纯度≥99.8%），国药集团化学试剂有限公司。所有化学品均按原样使用，无需进一步纯化。
F-7000荧光分光光度计，日本日立公司；
Direct-Q5超纯水系统，贝徕美生物科技公司；
KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器公司；
TG16-II台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂。
（二）试验方法
1.MAPbBr3钙钛矿量子点的制备。首先，将0.080 mmol MABr和0.20 mmol PbBr2溶解在0.40 mL DMF中，加入0.32 mmol OA和0.085 mmol APTES，在70℃加热至溶液透明。然后，将所有前体溶液快速注入甲苯（10.0 mL）中并暴露在空气中20 min。通过离心（4 000 r/min，10 min）收集沉淀物，用甲苯洗涤2次或3次。最后，将MAPbBr3钙钛矿粉末沉淀在真空中干燥过夜，并以所需浓度重新分散在甲苯中以进行进一步表征。
2.MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的制备。将4.0 nmol苯并［a］芘溶解在5.0 mL DCM中，然后加入10μL APTES。将含有模板和功能单体的溶液在室温下振摇2 h。添加不同体积的MAPbBr3钙钛矿量子点并搅拌30 min。随后，加入100μL TEOS并将混合物进一步搅拌12 h。将得到的MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器（MIP@MAPbBr3PQDs）离心，并用DCM洗涤数次以去除过量的反应物和模板。
非印迹复合材料（NIP@MAPbBr3PQDs）也用相同的方法制备和洗涤，但不加入苯并［a］芘。
3.苯并［a］芘的测定。将制得的MIP@MAPbBr3PQDs分散在DCM中，分别与质量浓度为10、20、30、40、50、100 ng/mL的苯并［a］芘溶液混合，在温度为25℃条件下，避光反应30 min，测试其在530 nm处的荧光强度，绘制“相对荧光强度-苯并［a］芘浓度”的标准工作曲线，得到工作方程。
将MIP@MAPbBr3PQDs分散在DCM中，再与样品溶液混合，在温度为25℃条件下，避光反应30 min，测试其在530 nm处的荧光强度，将所得荧光强度数值带入工作方程得到样品中苯并［a］芘的含量。
（一）MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的制备和表征MIP@MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器的制作过程如图1所示。首先，以OA和APTES为表面钝化配体制得MAPbBr3钙钛矿量子点，OA分子吸附在形成的MAPbBr3钙钛矿量子点表面，而APTES水解形成一层薄薄的二氧化硅，由于其惰性和光学透明的特性，进一步保护了MAPbBr3钙钛矿量子点[13]。然后，以BaP为模板分子，MAPbBr3钙钛矿量子点为荧光信号单元，APTES为功能单体，TEOS为交联剂，形成MAPbBr3钙钛矿印迹聚合物。最后对多余的模板分子进行洗脱，得到用于BaP检测的MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器。
图1 MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器制备过程
溶液的极性是影响MIP@MAPbBr3PQDs荧光发射的关键因素。高极性溶剂会导致荧光猝灭，甚至破坏MAPbBr3钙钛矿量子点的结构完整性（见图2）。与分子印迹聚合物层接枝后，二氧化硅层对MAPbBr3钙钛矿量子点具有保护作用，使得MAPbBr3钙钛矿量子点在甲苯、DCM等中极性有机溶剂中表现出较低的敏感性[14]。考虑到MAPbBr3钙钛矿量子点在溶液中的稳定性、溶液的毒性以及BaP在溶剂中的溶解度，选择DCM作为进一步试验的溶剂。图3为MAPbBr3钙钛矿量子点和MIP@MAPbBr3PQDs在DCM中的荧光激发和发射光谱。如图3所示，二者的激发峰均在300 nm和375 nm附近。荧光测量在激发波长为375 nm时进行，荧光发射约为530 nm。
图2 不同极性溶剂对MIP@MAPbBr3 PQDs荧光强度的影响
图3 MAPbBr3钙钛矿量子点和MIP@MAPbBr3 PQDs的归一化荧光激发和发射光谱
图4A为MAPbBr3钙钛矿量子点和MIP@MAPb Br3PQDs的X射线衍射（XRD）谱图。在15.08°、21.34°、30.26°、33.92°、37.26°、43.26°和46.02°的峰为MAPbBr3钙钛矿立方相的晶面[15]，证实了它的形成。在2θ＝20°～25°附近的峰属于二氧化硅的非晶相[16]，表明钙钛矿量子点被二氧化硅层包裹。MIP@MAPbBr3PQDs的衍射峰强度低于MAPbBr3钙钛矿量子点的衍射峰强度，说明MIP@MAPbBr3PQDs表面覆盖了更多的二氧化硅材料。对MAPbBr3钙钛矿量子点和MIP@MAPbBr3PQDs进行了傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析（见图4B）。如图4B所示，MIP@MAPbBr3PQDs的FTIR光谱与MAPbBr3钙钛矿量子点相似。470 cm-1处为Si-O弯曲振动带，790 cm-1处为Si-O-Si对称振动带，1 120 cm-1处为Si-O-Si不对称拉伸振动带。923 cm-1处的带属于Si-OH的拉伸振动，1 040 cm-1处的带属于Si-O-C的拉伸振动。690 cm-1处的带属于＝C-H弯曲振动，2 928 cm-1处的带属于有机硅烷链上的C-H键，1 476 cm-1和1 588 cm-1处的双峰为OA配体的COO-的伸缩振动。有趣的是，对于MIP@MAPbBr3PQDs，-NH2拉伸振动峰值从3 120 cm-1移动到3 038 cm-1。FTIR结果表明，APTES水解缩聚后在MAPbBr3钙钛矿量子点表面形成了包覆的二氧化硅层，-NH2拉伸振动峰的蓝移可能与氨基的缔合有关，OA通过羧基覆盖在MAPbBr3钙钛矿量子点表面。
图4 MAPbBr3钙钛矿量子点和MIP@MAPbBr3 PQDs的XRD谱图（A）和FTIR谱图（B）
（二）荧光定量分析为保证检测体系的灵敏度，在传感器用于苯并［a］芘检测之前，采用光谱法对制得传感器的光学性能、特异选择性进行测试表征，对交联反应时间、反应溶剂、功能单体用量、钙钛矿投加量等条件进行优化。
将不同APTES配比制备的MIP@MAPbBr3PQDs和NIP@MAPbBr3PQDs加入不同浓度的苯并［a］芘标准溶液，记录相应的荧光强度。荧光检测数据采用公式（1）呈现的方程拟合。
公式（1）中，F0和F分别为加入苯并［a］芘前后MIP@MAPbBr3PQDs荧光传感器的荧光强度；
KSV为反应平衡常数；
C为苯并［a］芘的浓度。
以苯并［a］芘浓度C为横坐标，钙钛矿量子点相对荧光强度为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。同时，利用非印迹钙钛矿量子点进行对比，印迹因子采用公式（2）呈现的关系式来计算。
公式（2）中，IF为印迹因子；
KSV，MIPs和KSV，NIPs分别由分子印迹钙钛矿量子点和非印迹钙钛矿量子点荧光强度数据方程求得。用印迹因子来评价钙钛矿量子点对苯并［a］芘的选择性。印迹因子高，说明分子印迹钙钛矿量子点具有很好的特异识别性。当利用溶剂萃取将模板分子洗脱后，印迹结合位点便在探针中形成，这些结合位点能够有选择性地结合苯并［a］芘。
在40μmol APTES和2.0 mL MAPbBr3PQDs条件下制得的MIP@MAPbBr3PQDs获得了最强的荧光响应，IF值为3.9（见表1），说明MIP@MAPbBr3PQDs对苯并［a］芘具有特异性识别能力，检测灵敏度高。试验平行测定含有20 ng/mL苯并［a］芘的MIP@MAPbBr3PQDs荧光信号，相对标准偏差为4.8%。试验根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）规定的检出限计算方法，计算出MIP@MAPbBr3PQDs对苯并［a］芘的检出限为1.6 ng/mL。
表1 MIP@MAPbBr3 PQDs和NIP@MAPbBr3 PQDs的“相对荧光强度-苯并［a］芘浓度”的线性方程、R 2和IF
（三）实际样品分析为了考察本研究制备的MIP@MAPbBr3PQDs能否在实际样品中使用，检测了从市场购买的葵花籽油中苯并［a］芘残留量。样品经提取程序后检测，未发现目标分析物，因此，采用加标测试回收率进行评估。
分别向样品中加入10、20、50 ng/mL的苯并［a］芘得到低、中、高添加浓度的样品。样品经乙腈提取后用弗罗里硅土固相萃取柱净化，用正己烷-二氯甲烷洗脱，再取制得的MIP@MAPbBr3PQDs与样品溶液混合，充分相互作用30 min，测试其在530 nm处的荧光强度。结果显示，葵花籽油样品中苯并［a］芘的加标回收率在79.3%～107.0%，且相对标准偏差均小于5.0%（见表2）。
表2 样品加标回收率测定结果 （n＝3）
（四）机理分析荧光检测的机理主要包括静态猝灭效应、动态猝灭效应、荧光共振能量转移、光诱导电子转移效应和内滤效应（见图5）。静态猝灭的发生是基于量子点与靶标物相互作用生成了非荧光基态复合物，此时量子点的荧光寿命几乎不变，但是吸收光谱会发生变化，生成复合物的稳定性会随着温度的升高而降低。动态猝灭是激发态的量子点与靶标物发生能量转移或物理碰撞，并返回基态的过程，此时量子点的荧光寿命有显著的变化，但是吸收光谱不会改变，随着温度的提高，动态猝灭效果更加显著。荧光共振能量转移的前提是量子点的发射光谱必须与靶标物的吸收光谱有重叠，量子点与靶标物分子在空间上足够接近，另外，量子点荧光寿命会随着靶标物浓度的增加而降低。在光诱导电子转移过程中，量子点和靶标物之间会生成复合物，量子点和靶标物之间会发生内部氧化还原反应。内滤效应只是简单的吸收过程。
在本研究中，钙钛矿量子点的发射光谱与苯并［a］芘的吸收光谱之间没有重叠，荧光共振能量转移不是该传感机理。由于苯并［a］芘分子结构中具有强吸电子基团，传感器对苯并［a］芘的荧光识别机制可能为光诱导电子转移。与此同时，由于钙钛矿存在表面缺陷，苯并［a］芘分子结构中含有多种官能团，在传感过程中苯并［a］芘可能会与钙钛矿晶体中配位不饱和的离子相互作用，起到钝化缺陷态效果，从而增强钙钛矿荧光强度。
本研究以MAPbBr3钙钛矿量子点为荧光信号单元，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂，苯并［a］芘为模板分子制备具有灵敏识别功能的MAPbBr3钙钛矿量子点-分子印迹荧光传感器，实现了对苯并［a］芘高灵敏度、高选择性的识别检测。该方法的线性检测范围为10～100 ng/mL，线性相关系数为0.993 96，检出限为1.6 ng/mL，检测精密度为4.8%。对葵花籽油样品中苯并［a］芘的加标回收率在79.3%～107.0%，且相对标准偏差均小于5.0%。该检测方法对苯并［a］芘具有实际检测价值和意义。分子印迹荧光传感器结合了分子印迹聚合物的识别性和高选择性以及荧光检测的高灵敏性，在药物分析、环境分析、食品分析等方面具有广阔应用前景，将对环境科学、生命和材料科学产生深远的影响。
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