阮音音，孙海，吴虎平，钱佳奇，梁浩，严光玉，张亚玉,3※
[1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；
2.成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106；
3.吉林省中药材种植（养殖）重点实验室，吉林 长春 130112；
4.瓦屋山药业有限责任公司，四川 眉山 620365]
雅连是毛茛科多年生植物三角叶黄连（Coptis deltoidea）的干燥根茎，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，一般用于湿热痞满、呕吐吞酸及消渴等症状[1]，在治疗糖尿病及消渴症方面有突出优势。雅连是最早有记载的黄连商品药材，可以追溯到西汉时期[2]，在明清时代甚至是川渝地区上贡的贡品[3]，是历史上公认的优良黄连药材，留有大量方剂传世，是值得传承的优良中药材。2012年，雅连成为地理标志产品，目前仅有四川洪雅、峨眉等少数地区有林下种植。
土壤细菌作为土壤微生物的组成部分，是森林生态系统的一部分，其群落多样性与伴生树种联系紧密。研究表明，植物的微生物群落具有能帮助植物抑制疾病、提供营养和对生物或非生物胁迫响应等功能[4-6]。David[7]提出，植被组成及植物凋落物类型会对土壤生物多样性产生影响。在生产过程中，选林也是种植前的重要步骤，如果选林不当，很可能发生烂根、枯叶等现象，从而造成减产甚至绝收。调查发现，不同树种对于雅连的生长具有极大的影响作用，有些树种下雅连的保苗较好，长势较好，产量较高；
而有些树种下雅连的生长受到抑制，病害重，产量低。但目前关于雅连林下种植及土壤微生物的研究未见报道。
本研究在产地调研的基础上，对主产区洪雅县雅连根区土壤微生物群落结构，结合土壤营养指标的对比分析研究，筛选适宜雅连生长的土壤微生物标志物种，探究雅连根区微生物群落结构与土壤营养指标的相关性，为雅连的林下种植选林、选土技术提供理论支撑。
1.1 材料
雅连样品的采集地点位于四川省眉山市洪雅县瓦屋山镇黑山村（103°9” E,29°28” N），海拔1 900 m，年降雨量1 435.5 mm，年日照1 006.1 h，年无霜期307 d，年平均气温16.6℃，属中亚热带湿润气候。采集时间为2020年9月20日，样品全部采自同一基地内，分别采自珙桐（Davidiainvolucrata）、少花桂（Cinnamomum pauciflorum）、猫儿屎（Decaisneainsignis）、核桃树（Juglans regia）、枫杨（Pterocarya stenoptera）以及漆树（Toxicodendron vernicifluum）6种树种下的雅连及其根区土壤。
表1 雅连及土壤样品采集点信息Table1 Information on sample collection points of Coptis deltoidea and soil
每个树种样地分别选择3个采样点，每个样点采集雅连3~6株。将表层枯枝落叶去除，采集0~30 cm的根层土壤，采集的土壤采用四分法进行混合。一部分装入10 mL无菌离心管80℃进行冷藏，用于土壤微生物测定；
另一部分风干后分别过0.85 mm及0.15 mm筛，并装于自封袋中进行保存，用于土壤营养指标测定。
1.2 方法
土壤有机质含量、全氮含量使用德国产元素分析仪Vario ELⅢ测定，其中土壤有机质的含量为全碳含量的1.724倍；
土壤全磷、速效磷含量采用钼锑抗比色法；
土壤全钾、有效钾使用火焰光度法测定；
铵态氮及硝态氮使用氯化钾浸提后，用AA-3流动分析仪进行测定（Brawn Luyy，德国）；
土壤的中微量元素采用硝酸-高氯酸消化-ICP710ES法。
采用Mo Bio/QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit对土壤微生物基因组DNA进行抽提，用16SrRNA基因V3-V4可变区引物（338F:5” -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3” ；
806R:5” -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3” ）进行PCR扩增（Pyrobest DNA Polymerase,TaKaRa,DR500A）；
然后进行胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,Axygen,AP-GX-500）；
然后进行各样本定量：利用BioTek酶标仪对各个样品定量（BioTek Flx800酶标仪；
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,Invitrogen,P7589）；
最后采用标准的Illumina TruSeq DNA文库制备实验流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）构建所需的上机文库。经过DNA双末端修复后，在3” 端引入“A”碱基，完成接头连接并纯化连接产物后，富集DNA片段，验证、均一化并混合文库，进行上机测序。本实验涉及的土壤样品DNA提取、扩增和上机测序技术委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
使用QIIME2及R语言及派森诺基因云平台对序列进行去噪、聚类、物种分类学注释、计算Alpha多样性指数、稀疏曲线、PCoA分析及NMDS分析等微生物群落多样性组成谱分析，使用Excel2019、SPSS26和Origin2022软件进行数据处理、统计分析与可视化表达。
2.1 不同树种下雅连根区土壤营养指标
不同树种下雅连根区土壤营养指标值，见图1。在有机质含量方面，猫儿屎组的含量（196.37g/kg±53.37g/kg）显著高于其他各样本组。枫杨组（4.88 g/kg±0.46 g/kg）及漆树组（4.83g/kg±0.71g/kg）的全氮含量显著高于少花桂组（3.02 g/kg±0.47 g/kg）。少花桂组（9.12±2.28 g/kg）及枫杨组（9.12 g/kg±6.19 g/kg）的土壤全磷含量显著高于其他各样本组，且少花桂组（13.56g/kg±3.22g/kg）的土壤全钾含量也显著高于其他各树种组。
图1 不同树种下雅连土壤大量元素含量Fig.1 Content of mass elements in soil under different tree species
不同树种下雅连根区土壤的中微量元素含量（表2）可知，土壤中金属元素钙、铜、铁、锰、镁、钠、锌、铝等在各样本组间均存在显著差异性。综合看来，漆树组的土壤中微量元素含量属于较低水平。
表2 不同树种下雅连土壤中微量元素含量Table 2 Soil medium and trace elements content under different tree species mg/kg
2.2 不同树种下雅连根区土壤16S测序数据的基本分析
对土壤样本16S测序数据质量进行分析，平均每个样品测得94 772对原始序列，去除部分低质量序列、去噪及嵌合体后，平均获得高质量序列55 826条，片段长度为162~441 bp，集中分布在405~432 bp区间内。对所有样品所得结果在97%的相似水平下进行生物信息统计分析，一共得到13 005条OTU，不同样品间的OTU数量变化范围为709~941。OTUs物种注释结果显示，6个样本组中的细菌群落结构中包含40门108纲268目481科1 024属2 735种。使用QIIME软件可以获得每个样品于不同的分类水平上的物种组成以及其相对分度表，对于其中丰度大于1%的细菌进行分析可以得到不同水平下的相对丰度柱状图。对不同树种间根区土壤间细菌在门、属水平下样品的分类学组成进行分析（图2 a和图2 b）。
在6种树种下，门水平的前10个优势菌种如图2 a所示，其中Proteobacteria（变形杆菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Chloroflexi（绿屈挠菌门）4个菌门占在各组所有菌门的80%左右，是绝对的优势菌门。对各组相对丰度前10的优势菌门进行方差分析，结果表明酸杆菌门在少花桂组及枫杨组中的相对丰度显著高于珙桐组及漆树组；
珙桐组的绿屈挠菌门丰度显著高于少花桂组、枫杨组、漆树组；
猫儿屎组的Bacteroidetes（拟杆菌门）丰度显著高于枫杨组；
Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）在枫杨组的丰度显著高于珙桐组及猫儿屎组；
Verrucomicrobia（疣微菌门）在漆树组中的相对丰度最高，显著高于其他树种。6个样本组相对丰度为前15的优势菌属如图2 b所示，分别为不同样本组的各菌属占比有明显不同，除了酸杆菌门下的Subgroup_2及变形杆菌门下Bradyrhizobium（慢生根瘤菌属）的在各组中相对丰度均处于较高水平外，各组物种组成差异很大。
图2 不同树种下土壤细菌群落Fig.2 Soil bacteria community of different interplanting models under different tree species
本研究选取的Alpha多样性指数（表3）包括Good’s coverage指数、Pielou’s evenness指数、Chao1指数及Shannon指数，分别说明物种覆盖程度、均匀度、群落丰富度及多样性。由表4可知，所有样品的细菌Good’s coverage指数均大于0.95，说明该样本测序可以比较真实的反映样本的情况；
核桃树及漆树组的均匀度显著高于猫儿屎组及枫杨组；
各组间丰富度不存在显著差异，但珙桐组属于较高水平；
珙桐及核桃树下雅连土壤细菌多样性显著高于猫儿屎及枫杨树下的雅连。
表3 不同树种下土壤细菌菌门相对丰度方差分析（*P＜0.05）Table 3 ANOVA on the relative abundance of soil bacterial phyla under different tree species(*P＜0.05)
表4 不同树种下土壤细菌Alpha多样性指数（*P＜0.05）Table 4 Alpha diversity index of soil bacteria under different tree species(*P＜0.05)
NMDS分析不受样本距离的数值影响，仅考虑彼此之间的大小关系。基于OTU注释结果，对不同树种下的的微生物菌落进行NMDS分析，结果见图3，其应力值（Stress）为0.038 9，远小于0.2，这表明该NMDS分析结果可以准确反映出不同树种下的组内菌落组成结构的差异程度。比较各样本组，珙桐组相比其他各组在图中位置较远，说明其土壤细菌群落结构与其他样品组差异较大；
少花桂组、猫儿屎组与枫杨组位置相对集中，其差异程度相对较小。
图3 不同树种下土壤细菌NMDS分析Fig.3 NMDS analysis diagram of soil bacteria under different tree species
利用LEfSe分析对所有分类水平同时进行具有显著性的丰度差异分析，寻找不同树种间差异显著的标志物种，结果见图4。珙桐组的特征物种为KD4-96纲、KD4-96目、KD4-96科、Hyphomicrobiaceae科（生丝微菌科）、KD4-96属、Pedomicrobium属（土微菌属）物种；
核桃树组标志物种为SC_I_84科、SC_I_84属；
枫杨组为Pseudolabrys属；
漆树组标志物种包括疣微菌门、Thermoleophilia纲、Verrucomicrobiae纲（疣微菌纲）、Chthoniobacterales目、Gaiellales目、Chthoniobacteraceae科、Candidatus_udaeobacter属。
图4 不同树种下土壤细菌LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis diagram of soil bacteria community under different tree species
在本研究中，使用平均丰度前20位的菌属丰度数据绘制热图以比较各样本组的物种丰度分布趋势。由图5可知，各样本组的细菌群落可以被聚类为4大组，其中第一组为枫杨组，第二组有样本组少花桂组及猫儿屎组，第三组为珙桐组，第四组包括核桃树及漆树在内，其中一二组之间物种组成相似性较高，而第四组组内的相似程度也很高，三四组的差异主要集中在AD3、慢生根瘤菌属这两个能被聚类的菌属以及Haliangium、Candidatus_udaeobacter、Rokubacteriales、Nitrospira这4个相似菌属上。
图5 不同树种下土壤细菌属水平物种组成热图Fig.5 Heat map of species composition at the genus level of soil bacteria under different tree species
2.3 不同树种下雅连根区土壤微生物群落及营养元素相关性
RDA冗余分析一般用于反应微生物菌群与土壤环境各因子之间的关系，见表5。结果表明，雅连根区土壤营养指标中仅铝、铜与速效钾对细菌群落结构有显著性影响，土壤各营养指标对土壤细菌门群落结果的前5影响顺序为铝＞铜＞速效钾＞硝态氮＞全钾。对土壤营养指标与丰度前15的细菌菌属进行Spearman分析（图6）可知，KD4-96属与土壤全磷、全钾、速效磷含量呈显著负相关，与锰、锌含量呈极显著负相关，与速效钾含量呈显著正相关，与钠、铝含量呈极显著正相关；
Roseiarcus属与土壤全磷、铁、镁含量呈显著正相关，与全钾、锰、锌含量呈极显著正相关，与钠含量呈显著负相关；
Rokubacteriales属与土壤全磷、锰含量呈显著负相关，与全钾、铁、镁含量呈极显著负相关；
Candidatus_udaeobacter属与土壤全钾、钙、铁、镁含量呈显著负相关，与铜、锰、锌含量呈极显著负相关。
表5 不同树种下土壤细菌群落与营养元素的RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil bacteria l community and nutrient factors under different tree species
图6 门水平下土壤细菌相对丰度与营养指标相关性（*≤0.05,**≤0.01）Fig.6 Correlation between relative abundance of soil bacteria and nutrient factors at phylum level(*≤0.05,**≤0.01)
微生物是土壤的重要组成成分，其功能包括参与土壤结构形成、养分转化、有机质循环和毒物降解等各类理化及生物过程，和土壤的健康以及质量息息相关[6,8]。不同树种下的土壤营养指标表现出了显著差异，其原因可能是树种的凋落物不同，从而影响了林下雅连根区土壤有机质和养分的补给[9]。研究表明，不同的树种凋落物所含有的不同碳源和氮源会导致土壤微生物群落结构进行定向进化，进而对土壤肥力产生一定的影响[10]。此外，不同树种的根系生长代谢也会影响土壤（尤其是根区土壤）的理化性质[11,12]。从土壤各营养指标来看，全磷、全钾及各金属元素更容易影响土壤的细菌群落结构，尤其是锰及锌这两种微量元素，与相当一部分的优势菌属都具有显著或极显著相关性。
6种树种下雅连根区土壤细菌的优势菌门为变形杆菌门、酸杆菌门和放线菌门，这与王钰等[13]在西南地区研究结果基本一致。土壤微生物种群对于土壤的质量和功能以及土壤生态系统的可持续性发展具有十分重要的意义；
在一定程度上，土壤微生物群落组成及类型可以反映出土壤质量的变化[14,15]。不同树种下雅连根区土壤细菌群落的多样性指数较高的是珙桐组，拥有较高水平丰富度及多样性。
疣微菌门及其门下的Candidatus_udaeobacter属是漆树组标志物种，有研究表明Candidatus-udaeobacter常为多年生作物的高年限时的优势种群[16]，其有可能是土壤微生态失调的产物，而土壤微生态失调往往导致土壤微生物群落的单一化群落结构明显。核桃树及漆树较其他树种而言，棒状杆菌门Rokubacteriales处于较高水平，且漆树下土壤细菌群落中Rokubacteriales为丰度最高的菌属。而在番华彩等[17]对香蕉枯萎病和健康植株根际土壤细菌群落结构的研究发现，发病植株中棒状杆菌门的丰度较健康植株高，香蕉枯萎病植株中Rokubacteriales丰度和健康植株的差异显著。目前针对雅连的病害研究较少，而作物病害的发生与植株根际土壤微生物有密切关系，主要体现在微生物数量及群落结构方面[18]。对于棒状杆菌门Rokubacteriales对作物影响的机制尚不明确，可能与病害发生有联系，仍需进一步的实验证实。
珙桐组的特征物种中，绿屈挠菌门的KD4-96属占重要地位，同时，其所在的KD4-96科、KD4-96目、KD4-96纲也为珙桐组的特征物种，这说明在珙桐组中该属起到关键作用。研究发现，KD4-96属与土壤中总磷含量呈正相关关系[19]，其对磷的溶解释放具有促进作用[20]，且为耐金属细菌[21]，属于有益微生物。珙桐组雅连生长状况较好，可能与KD4-96属的这些功能有密切关系，其影响机制需进一步实验验证。
土壤营养指标和土壤微生物群落结构组成受不同树种的影响，尽管不同树种下雅连根区土壤相对丰度占优势的微生物种群改变较小，但是标志微生物的地位存在差异。本研究中6种不同树种下的雅连土壤样品经16S测序，涵盖了40门108纲268目481科1 024属2 735种细菌。
6种树种下土壤细菌的优势菌门均为变形杆菌门、酸杆菌门、放线菌门，但不同样本组中的各优势菌属差异较大，Subgroup_2属及慢生根瘤菌属在各样本组中均处于较高水平，其中铝、锌、全磷、镁、铁、锰、速效钾和钠对细菌群落结构有显著影响。
珙桐树下的土壤细菌群落有相对较高的丰富度及多样性，其关键微生物是有益细菌绿屈挠菌门的KD4-96，而漆树下雅连生长状况较差可能是疣微菌门Candidatus_udaeobacter及棒状杆菌门Rokubacteriales所致。
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