王智慧 吴洁丽 项延包
先天性耳聋是人类最常见的出生缺陷之一。据报道，每1 000 名新生儿中约有1.5 例存在听力障碍，其中超过一半与遗传因素有关[1]。大约90%的先天性耳聋患儿出生在听力正常的家庭[2]，因此国家近10 年来广泛开展对新生儿耳聋基因的筛查，达到对耳聋患儿早期诊断及早期治疗的目的[3]。如能将遗传性耳聋基因携带者筛查提早到孕期，了解孕妇群体耳聋热点基因突变携带情况，有助于临床作出准确的产前咨询及产前诊断，达到优生优育的目的。本研究以温州市中心医院产前门诊的3 620 例听力正常、无耳聋家族史的孕妇为研究对象，进行常见遗传性耳聋基因筛查，并对夫妻双方携带同种基因的胎儿进行产前诊断，了解本地区常见遗传性耳聋基因突变频率和分布特征，以期为耳聋精准防控提供遗传学依据，现报道如下。
1.1 对象 选取2020 年2 月1 日至2022 年7 月31 日在本院产前门诊，无耳聋家族史且未曾接受耳聋基因携带者筛查的孕妇为研究对象，共纳入3 620 例听力正常的孕期女性，年龄21～43 岁，孕周＜18 周。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号：K2020-00-001），受检者知情同意并签署知情同意书后接受耳聋基因筛查。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 （1）口腔唾液标本采集：漱口后30 min，以专用唾液采集器留取口腔唾液5 ml，参照说明书提取唾液标本DNA（恺硕生物科技厦门股份有限公司试剂盒，备案号：闽厦械备20160003）。（2）胎儿羊水DNA 提取：进入产前诊断的孕妇于孕中期（17～26 周）在超声引导下抽取羊水10 ml，采用德国QIAGEN 公司QIAamp DNA mini Kit 抽提试剂盒参照说明书抽提羊水基因组DNA。取2 μl DNA 样本用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。
1.2.2 孕妇耳聋基因检测方法及判读 采用广州凯普医药科技有限公司生产的遗传性耳聋基因检测试剂盒（备案号：粤穗械备20170043），采用PCR+导流杂交法检测4个常见耳聋基因21个位点，具体如下。6 个GJB2 位点：c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG；
11 个SLC26A4 位点：c.281C＞T、c.589G＞A、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G、IVS7-2A＞G、IVS15+5G＞A；
2 个GJB3 位点：c.538C＞T、c.547G＞A；
2 个线粒体12S rRNA 位点：m.1494C＞T、m.1555A＞G。首先行PCR 法扩增（杭州博日PCR 仪）：采用PCR 法，对检测范围为4 个基因的目标位点位置用特异性引物进行目的片段的扩增，特异性引物的设计是专门针对目标位点，覆盖该位点上下游的100～200 bp 序列。然后进行导流杂交：将扩增产物与标记不同突变类型遗传性耳聋基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交。最后通过化学显色对结果进行判读：正常探针及对应的突变探针位点都出现蓝紫色斑点，为该位点的杂合突变或异质突变；
突变探针出现蓝紫色斑点，而对应的正常探针位点没有出现蓝紫色斑点，为该位点的纯合突变或均质突变。
1.2.3 GJB2、SLC26A4 基因携带者干预方案 GJB2、SLC26A4 基因为常染色体隐性遗传病，当夫妻双方均为相同基因携带者，后代有25%概率发生耳聋的风险。因此，对于孕妇检测结果显示GJB2 或SLC26A4 基因突变携带者时，召回其配偶进行相应基因Sanger 测序，若夫妻双方均携带有相同突变耳聋基因，在知情同意情况下，建议在孕中期（孕17～26 周）抽取羊水对胎儿进行产前诊断及相应的突变位点检测，进入产前诊断的孕妇同时行羊水胎儿染色体检查。
1.2.4 GJB3、线粒体12S rRNA 携带者干预方案 对于GJB3 基因携带者，有文献报道与高频听力损伤有关，会导致迟发性听力受损[4]，仅予遗传宣教，注意听力变化，不进行配偶筛查及产前诊断。对于孕妇检测结果提示为m.1494C＞T、m.1555A＞G 携带者，因其为线粒体的母系遗传，为氨基糖苷类抗生素敏感个体，予告知应终生绝对禁止使用氨基糖苷类抗生素，以避免耳聋的发生。
1.3 观察指标 （1）孕妇耳聋基因筛查结果；
（2）耳聋基因携带者配偶基因检测及产前诊断结果。
2.1 孕妇耳聋基因筛查结果 3 620 例听力正常孕妇接受耳聋基因筛查，共检出携带常见耳聋基因突变者163 例（4.50%）；
检出5 种GJB2 基因突变共85 例，其中c.235delC 突变率最高，共65 例（1.80%）；
检出6 种SLC26A4 基因突变共44 例，其中IVS7-2A＞G 突变率最高，共33 例（0.91%），见表1。
表1 3 620 例孕妇耳聋基因筛查结果
2.2 耳聋基因携带者配偶基因检测及产前诊断结果 在163 例孕妇耳聋基因携带者中，共有129 例为GJB2、SLC26A4 基因携带者，对其配偶进行召回，并建议其配偶进一步行相应基因测序，结果共有118 例配偶进行了耳聋相应基因的Sanger 测序，检出8 例携带者，其中1 例因胎儿多发畸形引产未做产前诊断，7 例进行羊水穿刺染色体培养加染色体微阵列分析（CMA）及耳聋基因鉴定，结果1 例为GJB2 c.235delC纯合突变，1 例为SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G 复合杂合突变，患者选择终止妊娠。1 例染色体检查确诊为21-三体综合征引产，见表2。
表2 118 例耳聋基因携带者配偶耳聋基因携带情况及产前诊断结果
耳聋严重影响人类生活质量，根据是否伴有耳外组织病变分为综合征型和非综合征型耳聋，其中约70%的非综合征型耳聋与遗传因素有关，目前没有有效的治疗手段。迄今为止，已鉴定出非综合征型耳聋基因至少124 个（https://hereditaryhearingloss.org，其中已鉴定出78 个基因与常染色体隐性遗传的非综合征型耳聋相关，截至2021 年8 月30 日）。因此耳聋基因携带者筛查和产前诊断是预防遗传性非综合征型耳聋患儿出生或外界因素导致的听力损失最直接有效的方法。本研究采取口腔唾液标本，对我国常见的4个耳聋基因中的21 个致病位点进行筛查。自2020 年2 月1 日 至2022 年7 月31 日 共3 620 例听力正常且无耳聋家族史的孕妇接受耳聋基因筛查，发现总共有163 例携带者，提示温州地区孕妇群体中常见耳聋基因的携带率约为4.5%，略低于沈阳地区孕期听力正常女性遗传性耳聋基因携带率[5]，与武汉地区听力正常人群耳聋基因携带率相似[6]。
GJB2 基因位于13 号染色体13q12.11 区域，是最常见的致聋基因，约50%的常染色体隐性遗传性耳聋患者存在GJB2 基因突变[7]。GJB2 基因在不同地域、不同种群中热点突变位点不同，c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG 为我国多区域常见的致聋位点，临床上常将这些基因突变位点作为普通感音神经性耳聋患者的检测位点，其中c.235delC 是我国人群携带率最高的位点，也是温州地区非综合征型耳聋主要致聋基因位点[8]。在本研究中，检出5 种GJB2 基因突变共85 例，其中65 例为c.235delC 携带者，携带率为1.80%（65/3 620），占全部耳聋基因携带者的39.88%（65/163），这与我国惠州地区筛查结果相近[9]。其次为c.299_300del AT 杂合突变共9 例，占5.52%（9/163）；
c.176_191del16杂合突变5 例，占3.07%（5/163）；
c.508_511dupAACG 杂合突变4 例，占2.45%（4/163），c.35delG 突变2 例，占1.23%（2/163），提示温州地区GJB2 热点基因携带谱较广，且检出率高，携带者筛查具有重要意义。
SLC26A4 基因突变与大前庭导水管综合征有关，临床表现为出生时听力正常或轻度至重度听力下降，但因为坠床、儿童玩耍、跌倒或轻度碰撞等情况致聋，称为“一巴掌耳聋”，临床影像学诊断较为困难。笔者团队前期针对温州地区187 例耳聋患者的研究发现，温州地区非综合征型耳聋患者SLC26A4 基因携带率达11.76%，其中c.919-2A＞G（IVS7-2A＞G）、c.2168A＞G 是温州地区SLC26A4 基因突变最主要的类型[10]。本研究针对SLC26A4 基因在我国人群中常见的11 个位点进行携带者筛查，共检出6 种SLC26A4 基因突变位点共44 例，携带率为1.2%，其中IVS7-2（A＞G）突变率最高，共33 例（0.91%），其余位点携带率较低，这与笔者团队前期对温州地区耳聋患者的检测结果相同[10]，提示IVS7-2A＞G 为本地区SLC26A4 基因致聋最常见的突变位点。
m.1555A＞G 和m.1494C＞T 是12S rRNA 基因的主要致病突变，已被证实与氨基糖苷类抗生素诱导的听力损失有直接关系[11]，以母系遗传为特点，一人检出，便提示所有母系亲属均为携带者，有药物致聋风险。一项关于新生儿听力筛查的研究发现，几乎所有12S rRNA 携带者都通过了听力测试，因此不能通过体格检查鉴别出是否为该基因携带者，这类携带者如使用氨基糖苷类抗生素就会导致不可逆的耳聋，基因筛查可有效避免此类不良事件的发生[12]。本研究中，有13例孕妇是m.1555A＞G 携带者，2 例孕妇为m.1494C＞T携带者。如果这类孕妇的婴儿出生后使用氨基糖苷类抗生素，会发生不可逆的听力损失。本研究帮助这15 个家庭的孩子避免氨基糖苷类抗生素引起的药物性耳聋等情况的发生。
GJB3 中c.538C＞T 和c.547G＞A 位点的变异为常染色体显性遗传，已证明主要导致高频听力损失[13]，被认为是迟发性耳聋的原因之一[14]。GJB3 虽为我国耳聋基因筛查常规项目之一，但目前没有明确依据证明该基因为耳聋患者的根本致病位点[15]，本研究共筛查出14 例为c.538C＞T 携带者，5 例为c.547G＞A 携带者，针对这19 例携带者，笔者团队仅建议其避免接触高频声音，并注意听力变化。
本研究通过电话随访并对85 例GJB2 携带者及44例SLC26A4 携带者的配偶进行召回，结果118 例配偶接受耳聋基因检测。本研究采用Sanger 测序法对配偶携带的相应基因进行测序，发现8 例为携带者，其中1例因胎儿多发畸形引产拒绝基因检测，7 例进行羊水穿刺产前诊断，结果1 例为GJB2 c.235delC 纯合突变，1 例为SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G复合杂合突变，患者选择终止妊娠。1 例染色体检查确诊为21-三体综合征引产，笔者建议胎儿耳聋基因检测时同时行染色体检查。
综上所述，温州地区孕妇群体4 种常见耳聋基因的携带率约为4.5%，GJB2 基因c.235delC 位点、SLC26A4 基因IVS7-2A＞G 位点是温州地区孕妇群体常见的耳聋基因变异位点，通过对温州地区听力正常的孕妇进行遗传性致病性耳聋基因筛查，有助于对携带者进行遗传咨询及产前诊断，实现遗传性耳聋的二级预防，提高出生人口素质，实现优生优育。
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