吕若萱，王秀华，李 晨，连新宇，3，杨 冰
（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业农村部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，山东青岛 266071；
2.上海海洋大学，上海 201306；
3.浙江海洋大学，浙江舟山 316022）
环境DNA（environmental DNA，eDNA）研究始于1987年，被定义为可检测到的短DNA/RNA片段。这些片段来自活生物体的细胞成分或其分泌到周围环境（水、空气、沉积物）的非生物成分短核酸片段[1-3]。eDNA样本被提取后，可以使用多种分子生物学方法检测目标片段，包括普通PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）、Sanger测序等[4-5]。此外，eDNA可直接作为宏基因组学文库进行测序，或者在特定目标基因区域进行PCR扩增后测序。近年来，eDNA 技术已被应用于生态系统的物种多样性研究、资源生物量检测以及濒危种和入侵种检测。在水样、土壤及沉积物等环境中检测eDNA，对于深入了解和保护水生动物生态具有巨大潜力[6]。
利用eDNA方法监测水生系统疫病的研究越来越多，涉及两栖类[7-9]、鱼类[10-12]、甲壳类[13-15]等多种水生动物。它具有成本低、效率高、非破坏性的特点，对监测高价值或稀有动物疫病优势明显。作为组织样本采集的辅助方法，eDNA方法在早期发现野生和养殖动物群体的疫病入侵或感染导致非明显临床症状的情况下具有潜在作用。为此，世界动物卫生组织（World Organization of Animal Health，WOAH）正与各成员讨论将该方法应用于水生动物疫病诊断国际标准的可能性[16]。但eDNA方法也存在缺乏验证以及诊断灵敏度易受影响的问题。本文探讨了eDNA方法在水生动物疫病监测方面的潜在用途，以期为深入开展eDNA方法在水生动物疫病监测方面的应用提供参考。
相比直接采样检测，eDNA方法存在很多优点：eDNA方法不要求对水生动物宿主进行侵入性或致死性采样，尤其对稀有或有价值的水生动物或难以采集和捕捉的野生动物特别有优势[17]；
不需要处理动物，避免了获取非破坏性组织样本相关的压力[18]；
与单个动物样本的采集和处理相比，样本采集和样本处理时间及相关成本可能会大幅减少[17]；
环境样本可能涉及整个或大部分养殖种群的动物，即使eDNA方法的诊断灵敏度较低，检测病原所需的样本也可能会少得多（与单个动物样本相比）。Ardura等[19]运用eDNA方法寻找欧洲泥蜗牛（Peringia ulvae）在横纬度航行压载水中潜在生存的分子证据，证明了eDNA方法可用于对宿主无法采样情形下的检测或评估。
2.1 两栖动物
两栖动物具有可渗透的皮肤，对环境干扰的敏感性强同时具有两重性的生活方式，通常被认为是生态系统的健康指标。而两栖动物种群正在逐步消失或减少，其原因除栖息地退化和环境被破坏外，新发传染病也是重要原因之一[20]。例如：蛙壶菌（Bartrachochytrium dendrobatidis）导致至少501种两栖动物物种数量减少，其中90种推测已灭绝[21]；
蛙病毒属（Ranavirus）被认为是导致两栖动物死亡的常见病原[22]；
新发病原蝾螈壶菌（Batrachochytrium salamandrivorans）导致欧洲火蝾螈（Salamandra salamandra）大规模死亡。
而快速准确识别病原微生物对于早期发现感染，以便采取适当的缓解措施至关重要。近年来，环境样品（如水）中的病原DNA 检测已被成功用于鉴定多种水生动物寄生虫、壶菌、卵菌和蛙病毒。
目前，检测蛙壶菌主要通过收集两栖动物宿主的皮肤拭子，从拭子中提取DNA，使用qPCR方法检测病原体的存在和数量[23]。eDNA方法采用非侵入性采样方法，对于检测蛙壶菌具有较大潜力。有研究[24-26]通过过滤水样以获得游动孢子和游动孢子囊，然后对过滤颗粒使用qPCR方法进行检测，成功从小体积（＜1 L）水中检测到蛙壶菌的存在。该方法具有较高的分析灵敏度，检测限低至0.1游动孢子[23]，甚至0.06游动孢子[25]。研究[27-28]显示，在两栖动物死亡前的栖息地中，采用eDNA方法检测到大量蛙壶菌的存在，并且疫病暴发期间在环境表面也发现了蛙壶菌的存在[28]，表明eDNA方法可用于疫病预测，或者提供疫病暴发期间研究栖息地病原是否存在的依据。
Hall等[29]发现，在初始死亡事件发生前约15 d和发生后约30 d，eDNA样本中均可检测到蛙病毒，表明即使未观察到死亡，采用eDNA方法亦可在水体中检测到蛙病毒。
主动和被动监测是确定两栖动物感染状态和需要采取保护措施的关键因素[23]。目前蝾螈壶菌的主动监测主要通过收集两栖动物宿主的皮肤拭子[30]，使用qPCR技术检测是否存在该病原DNA[31]，因此需要进行大量个体采样，成本高昂。而eDNA方法已被证明具有更高的检测能力和成本效益。研究[32-33]表明，可以在天然水体和沉积物中检测到蝾螈壶菌DNA。Brunner等[18]提出了针对蝾螈壶菌，从有限种群中收集合并单个样本（如拭子）和eDNA样本的公式，并讨论了使用它们的关键假设和考虑因素，表明eDNA方法在减少样本量等方面具有很大应用潜力。
2.2 鱼类
随着鱼类养殖规模的不断扩大和集约化水平的提高，鱼类病害的发生日益频繁，成为制约水产养殖业发展的重要因素之一。而通过eDNA方法检测病原体可以更早地识别鱼类种群中的感染情况，防止病原进一步传播。
鲑鱼甲病毒（SAV）是大西洋鲑、虹鳟鱼等鱼类胰腺病的主要病原。目前检测SAV的方法主要为鱼类组织取样、组织病理学诊断和qPCR检测。这些致死性取样方式耗费时间和资源。水平传播研究[34-35]表明，可直接从海水中检测到SAV。有研究通过过滤水来检测水环境中的病原，如鱼类体外寄生虫Gyrodactylus salaris[17，36]和SAV3亚型[12，37]。
锦鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）可感染鲤鱼（Cyprinus carpio）和锦鲤（Cyprinus carpio koi），对养殖产生巨大影响。CyHV-3存在于受感染鱼类的肠、肾和鳃等多个器官中[38]，粪便中也可检测到 CyHV-3[39]，因此水体和池塘沉积物可能也有CyHV-3的存在。Honjo等[40]建立了一种使用病毒浓度法和TaqMan PCR 结合外标病毒定量检测环境水体中CyHV-3的方法，表明来自不同环境水域的CyHV-3和外部标准病毒的回收率呈正相关，揭示了天然水中存在高水平的病毒DNA（超过2×105copies/L）。Honjo等[41]还建立了使用外标病毒对天然沉积物中CyHV-3 DNA 进行定量检测的方法，并发表了关于天然湖泊或池塘沉积物中存在CyHV-3的第一份报告，证明沉积物中的CyHV-3 DNA浓度高于水中的浓度。
2.3 甲壳类动物
在甲壳类动物疫病中，对虾白斑综合征病毒（WSSV）、急性肝胰腺坏死病（AHPND）病原、虾肝肠胞虫（EHP）、传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）等病原，对对虾养殖业造成严重威胁[42-44]，因此开展此类疫病监测至关重要。Wang等[45]依据eDNA原理及技术实现了对环境水体中IHHNV的浓缩和检测。张娜等[46]基于eDNA技术优化了检测环境水体中WSSV的切向流浓缩方法，但需要进一步研究来评估水环境和土壤中WSSV存在的风险，以对WSSV有更深入和全面的了解。
鳌虾瘟不仅可以使本地小龙虾种群面临灭绝风险，对自然生态系统也构成严重危害。鳌虾瘟是通过变形丝囊霉菌（A.astaci）孢子传播的。而Strand等[47]证明eDNA方法能够直接从大型淡水系统中检测到A.astaci孢子，还发现鳌虾种群中的A.astaci流行率、组织中的感染程度和湖水中的A.astaci孢子密度水平呈正相关，表明该方法在鳌虾瘟监测中具有巨大潜力。
2.4 软体动物
软体动物分布于淡水、海水和陆地，在生态系统和群落结构中发挥着非常重要作用，可保持生态平衡和净化水环境。对于软体动物，使用eDNA方法检测病原相对于其他水生动物起步较晚，研究较少。已有运用eDNA方法来检测和量化环境水体中寄生虫等病原的研究[48-50]，并且针对DNA回收率和环境样本中可能存在的抑制剂影响进行优化[48]。
近年来eDNA 技术发展迅速，不仅被应用于监测濒危种和入侵种，评估生物量，还被用于检测种群遗传特征，评估水生生态系统生境等，已成为阐明生态学，如生物多样性监测、生物量估算及水生动物健康状况监测的有力工具。eDNA方法可有助于增强主动监测，以便进行早期检测，特别对稀有、有价值或难以采集样本的野生水生动物有较大的应用优势，对水生动物养殖环境中的疫病监测具有成本优势。
但eDNA方法在病原检测方面存在一定的局限性。由于环境对检测对象的稀释和核酸的降解，环境样品中的目标病原DNA/RNA可能很少，这将对其灵敏度产生负面影响[18]。环境样本中目标DNA/RNA浓度会因一系列因素而变化，如宿主密度、感染率、感染强度、取样方法（例如取样水量、过滤器孔径、储存条件）和环境条件（例如有机物量、紫外线）。因此，eDNA方法的检测灵敏度在不同地区、不同时间点和不同目标分类群之间的差异可能比直接进行动物组织采样检测差异更大[18]。与动物组织样品相比，环境样品中的目标病原DNA/RNA阳性很可能来自非活病原的污染源，例如热处理产品中的灭活病原体，因此eDNA检测阳性并不代表宿主动物感染了目标病原。
基于eDNA检测的实际应用效果取决于样本收集和处理方法（如体积过滤、PCR抑制剂的存在和去除）、生物过程（如脱落率、时间变化）和非生物因素（如分析物降解、水动力因素）。对这些因素进行经验评估非常重要，这样才能正确解释结果。只有清楚地了解这些因素如何影响病原体检出的概率，基于eDNA的检测才能在各种环境中被可靠地使用。
目前我国水产养殖产量呈不断上升趋势[51]，而水生动物疫病是制约水产养殖产量的主要因素。eDNA方法可以有助于增强水生动物疫病主动监测，尤其是宿主在疫病入侵或宿主感染病原体后没有临床症状的情况下。通过eDNA方法可以有效了解病原体的传播机制并可及时制定暴发时的控制措施。对于稀有或有价值的水生动物等，环境采样优于动物采样，且eDNA检测方法符合动物福利国际标准的需求。eDNA检测作为一种具有应用前途的工具，在水生动物疫病监测方面有重要意义。
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