巫艳慧，唐诗琦，杜秋函，林 莹，符 珍
（广西大学轻工与食品工程学院 南宁 530004）
辣木（Moringa oleifera，MO）又称苄橄榄树、鼓槌树、角树，是一种具有高利用价值、实用价值和营养价值的多年生植物，原产于印度北部和北欧的部分地区，现分布在亚洲、非洲、中美洲和南美洲，分布面积广泛[1]。果实成熟期采摘的辣木果实，即辣木籽（Moringa oleifera seeds，MOS）。MOS 营养成分极其丰富，含有大量脂肪、蛋白质、多糖、矿物质元素和膳食纤维等，被誉为“植物钻石”[2]。研究显示，摄入辣木籽粉可使糖尿病大鼠的肾功能参数显著增加和改善[3]，MOS 还具有的抗关节炎特性[4]。多种研究指出辣木籽蛋白功能特性优于其它植物蛋白，辣木叶及种仁中蛋白质含量为牛奶的4 倍[5]。另外，辣木中含有多种人体必需的氨基酸，尤以赖氨酸和苏氨酸含量最高[6]。辣木籽的市场开发主要用于榨油，而榨油后留下的辣木籽粕，粗蛋白含量达50%以上[7]。
超声波在溶液中传播主要是通过产生空化效应和机械效应等多重物理作用，对蛋白质构象产生较大影响且不会显著改变氨基酸排列顺序。据报道，超声波已广泛应用于大豆、玉米等的研究中，对其功能特性具有显著的提高作用[8-11]。高强度的超声处理可以通过改变蛋白的空间结构，如改变蛋白质二三级结构，来提高溶解度、吸水性等功能特性[12-13]。近年来，许多科研人员对玉米蛋白、芸豆蛋白、玛咖蛋白等易获取的植物蛋白进行模拟人体胃肠消化研究，以酶解后的多肽作进一步分析，寻找具有高抗氧化能力的植物性多肽[14-16]。许多研究表明，经过脱酰胺、糖基化等化学改性和热处理等物理改性对蛋白质结构的改变，会进一步影响酶解消化后多肽活性以及抗氧化能力[17-18]，为多种植物蛋白在创新食品和定向改性蛋白质食品中的应用提供理论依据。
本文探究经不同超声功率改性的辣木籽水溶蛋白（MOWP），对体外消化特性和消化产物抗氧化活性的影响，寻找适合的超声条件，以提高MOWP 消化率、水解度和抗氧化性能。
1.1 材料与试剂
辣木籽，市售，粉碎后过80 目过筛。
胃蛋白酶（1 ∶3000，PS3）、胰蛋白酶（1：250，EC 3.4.4.4）、胰酶粉（1 ∶4000）、胆汁盐、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、菲洛嗪、邻苯二甲醛（OPA），索莱宝科技有限公司；
过硫酸钾、过氧化氢、氯化亚铁、β-巯基乙醇，上海源叶生物科技有限公司；
硫酸亚铁、水杨酸、四硼酸钠，广西南宁楚杰生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SHZ-88 水浴恒温震荡器，江苏金怡仪器科技有限公司；
CR21N 高速冷冻离心机，Himac 公司；
PHSJ-3F pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；
722 可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 辣木籽水溶蛋白的制备 根据Tang 等[19]的方法制备，取适量辣木籽粉末加入正己烷脱脂2 h，取辣木籽粉末晾干。脱脂辣木籽粉末中加入蒸馏水（1 ∶25 g/mL），室温条件下进行磁力搅拌2.5 h，然后将提取液在8 000 r/min、4 ℃的条件下离心25 min，取上清液备用。重复上述提取过程，合并两次上清液后加入0.5 mol/L HCl 调节上清液pH 值至4.5 等电点沉淀。等电点沉淀后以上述相同条件离心，取蛋白质沉淀，再透析36 h，冷冻干燥得到MOWP 粉末。此方法得到的MOWP，经HPLC 检测，纯度为（93.84±1.32）%。
1.3.2 超声处理辣木籽水溶蛋白 采用20 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.2）配制1% MOWP 悬浮液，室温条件下磁力搅拌2 h 后将烧杯置于冰水浴中。按照超声功率0，130，260，390，520，650 W（总功率的0%，20%，40%，60%，80%，100%）超声波细胞破，工作时间为3 s，间歇时间2 s，超声处理总时间15 min[20]。全程保持溶液低温。取出后透析48 h，冷冻干燥，得到超声处理的MOWP 样品。样品名称为MOWP、MOWP-20、MOWP-40、MOWP-60、MOWP-80、MOWP-100。
1.3.3 模拟体外胃肠消化 根据刘艳美等[21]的胃肠液消化方法并稍作修改。取未超声和超声处理后的MOWP 样品溶于0.9% NaCl 配置成10 mg/mL 蛋白质溶液，常温条件下磁力搅拌分散30 min，0.5 mol/L HCl 调节溶液pH 值至2.0，放置于37 ℃水浴保温30 min 待消化。将胃蛋白酶溶于0.1 mol/L HCl 配制成为20 mg/mL 胃液，调节pH值至2.0，放置于37 ℃水浴保温30 min 待消化。以V蛋白质溶液∶V胃液=50∶1 在37 ℃条件下水浴振荡酶解2 h 模拟胃消化。消化结束后取10 mL 胃酶解液放置沸水浴灭酶10 min，剩余胃酶解液用于模拟胃肠连续消化。将灭酶的酶解液冷却后以10 000 r/min 离心30 min，取上清酶解液以作备用。
将剩余胃酶解液迅速调节pH 值至7.5，以V蛋白质溶液∶V肠液=50∶1 加入37 ℃水浴保温的肠液（肠液：5 mg/mL 胰蛋白酶+5 mg/mL 胆汁盐+5 mg/mL 胰酶）中，37 ℃水浴振荡酶解2 h 模拟肠消化。消化结束后肠酶解液放置沸水浴灭酶10 min，冷却后混合酶解液以10 000 r/min 离心30 min，取上清酶解液以作备用。
1.3.4 模拟体外胃肠消化消化率的测定 取1.3.3节模拟胃肠连续消化的胃酶解液和胃-肠酶解液灭酶的上清液。采用凯氏定氮法测定上清液含氮量，以公式（1）计算样品消化率。
1.3.5 模拟体外胃肠消化水解度的测定 根据Elena 等[22]的水解度测定方法并稍作修改。取200 μL 的未处理MOWP 和超声处理MOWP 的酶解液加入3 mL OPA 混合试剂，摇匀避光静置2 min，在波长340 nm 处测定吸光值，未经水解样品吸光值为A1，水解样品吸光值A2，水解度（H）参照公示（2）计算。
式中，d——原样品与酶解液稀释倍数；
C——蛋白质质量浓度，g/L。
OPA 混合试剂的配制方法如下：0.1 mol/L 四硼酸钠25.0 mL 中加入0.5 g SDS，再加入1.0 mL甲醇溶解的40 mg OPA 和100 μL 的β-巯基乙醇，定容至50 mL，摇匀即可。
1.3.6 消化产物SDS-PAGE 的测定 取1.00 mg不同处理条件的MOWP 加入400 μL 尿素和100 μL 5 倍样品缓冲液，煮沸5 min 后10 000 r/min离心5 min。采用12%分离胶和5%浓缩胶，Marker（标准蛋白）上样量为5 μL，样品上样量为10 μL，浓缩胶和分离胶电压分别为80 V 和120 V[23]。电泳结束后取出凝胶片，考马斯亮蓝R-250 染色液染色0.5 h，脱色至条带清晰后使用荧光成像系统对凝胶片图像采集成像。
1.3.7 消化产物内源荧光的测定 内源荧光扫描采用荧光分光光度计测定。将MOWP 溶液（0.2 mg/mL）溶解于PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）中。激发波长为290 nm，发射波长范围为300～500 nm[24]。
1.3.8 消化产物DPPH 自由基清除率的测定 DPPH自由基清除率根据DPPH 化合物与蛋白质中的自由基反应，在波长517 nm 处具有强烈的吸光值，其测定参数如表1所示。
按照表1所示的参数测定，其中采取0.1 mmol/L 的DPPH 无水乙醇试剂溶液进行测定。混合对应试剂后在室温条件下避光反应30 min，于波长517 nm 处测定对应吸光值，DPPH 自由基清除率计算参照公式见式（3）。
表1 DPPH 自由基清除率测定参数Table 1 DPPH·determination parameters of free radical scavenging rate
1.3.9 消化产物ABTS 自由基清除率的测定 将7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 过硫酸钾以体积比1∶1 的比例混合均匀，黑暗条件下放置16 h 得到ABTS 混合液。采用去离子水稀释ABTS 混合液直至ABTS 混合液吸光值为0.7±0.02 以作备用。取0.5 mL 酶解液加入调节后的ABTS 混合液，混合均匀，避光静置10 min，在波长734 nm 处测定吸光值为A3。取0.5 mL 无水乙醇加入调节后的ABTS 混合液，混合均匀，避光静置10 min，在波长734 nm 处测定吸光值为Ac[14]。ABTS 自由基清除率计算参照式（4）。
1.3.10 消化产物羟自由基的测定 取0.5 mL 酶解液加入0.5 mL 6 mmol/L 的硫酸亚铁和0.5 mL 0.01%水杨酸，混匀后37 ℃条件下静置30 min，于波长510 nm 处测定吸光值为A4；
去离子水代替水杨酸测定其吸光值为AX；
去离子水代替酶解液测定其吸光值为AY[16]。羟自由基计算参照式（5）。
1.3.11 消化产物金属螯合力Fe2+的测定 参考韩苗等[26]的测定方法并略作修改。取1.0 mL 酶解液加入0.05 mL 2 mmol/L 的氯化亚铁和0.1 mL 5 mmol/L 的菲啰嗪，混合均匀后室温静置10 min，在波长562 nm 处测定吸光值A5；
采用去离子水代替酶解液测定吸光值AZ。金属螯合力Fe2+计算参照式（6）。
1.4 数据处理
试验均重复测量3 次，数据以平均值±标准偏差表示。试验绘图与分析分别采用Origin 9.1 对数据进行绘图，IBM SPSS Statistics 20 软件进行显著性分析。
2.1 超声功率对MOWP 消化率的影响
图1 显示超声处理对提高MOWP 模拟体外胃肠消化的消化率作用。以胃酶解液和胃肠连续消化酶解液为基础，分析发现高功率超声（P＞60%超声功率）可显著（P＜0.05）提高MOWP 在胃环境的消化率，MOWP-100 的消化率可达（68.52±1.70）%，而MOWP-40 低于未处理MOWP，其消化率16.97%。胃肠连续消化的MOWP 消化率也得到相似变化趋势，MOWP-100 的消化率最大为（91.48±0.64）%。龙佩[18]在探究超声强度对4 类谷物蛋白（小麦蛋白、荞麦蛋白、玉米蛋白和大米蛋白）消化率的影响时也发现400 W 左右的超声强度对谷物蛋白消化率具有极显著的提高作用。根据消化结果显示低功率超声作用并未呈现高消化率，这可能是由于多肽链部分化学键重排后使多肽内部处于较稳定空间构象，如α-螺旋含量增加。随超声功率增大和肠液的进一步消化，α-螺旋含量随之降低，MOWP 分子粒径减小，分子间趋于稳定但分子内部稳定性减弱使得MOWP 消化率显著上升。
图1 不同超声功率对MOWP 的胃肠消化率的影响Fig.1 Effect of different ultrasonic power on gastrointestinal digestibility of MOWP
2.2 超声功率对MOWP 水解度的影响
植物蛋白酶解后的水解度均为较低状态，大豆蛋白、糙米蛋白等多种蛋白的水解度均小于20%[26-27]，为提高蛋白质水解度，采用物理、化学等改性手段提高水解度。超声功率对MOWP 水解度的影响如图2所示，MOWP-40 在胃消化和胃肠连续消化水解度分别为（5.52±0.12）%和（29.30±0.15）%，均高于未处理MOWP 和高功率处理的MOWP，该情况与消化率变化趋势相反。当超声功率达100%时，胃消化和胃肠连续消化中水解度低于未处理MOWP。
图2 不同超声功率对MOWP 的水解度的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on gastrointestinal digestive hydrolysis degree of MOWP
根据图中变化趋势分析推测MOWP 分子可能是由于低功率超声处理导致分子内部结构不稳定，多肽链随着化学键重排后更多的α-氨基暴露于肽链外部与OPA 和β-巯基乙醇相互反应，肠液中的复合酶加强α-氨基的暴露较胃消化呈显著提高。吴瑕等[25]在研究碱性蛋白酶分解大豆分离蛋白时也得到超声改性会提高蛋白质水解度的相似结论，高功率超声处理会最大程度提高大豆分离蛋白水解度。Liu 等[27]和张淼[16]针对该现象分别指出酶种类对蛋白质水解度产生较大影响。
2.3 超声功率对MOWP 消化产物亚基的影响
图3 表示未酶解MOWP 和超声处理后MOWP 在胃肠消化后分子质量变化。经酶解处理后，蛋白质降解成分子质量更小的蛋白。经模拟胃消化水解后的酶解液主要由4 ku 和14～17 ku 亚基肽段组成，其中14～16 ku 亚基肽段含量较大；
当超声功率小于40%时，亚基肽段分子质量主要为14 ku。经模拟胃肠连续消化水解后的酶解液主要由14～16 ku 亚基肽段组成，随超声强度增强，肽段分子质量变化趋势与胃消化相同。图3b 和图3c 两图对比分析还可知胃肠连续消化较胃消化亚基含量少，表明在消化后期可消化蛋白质分子已显著降低。
图3 超声功率对MOWP 的胃肠消化产物SDS-PAGE 图谱Fig.3 SDS-PAGE pattern of gastrointestinal digestive products of MOWP by ultrasonic power
进一步分析SDS-PAGE 图谱发现超声功率超过20%能改变MOWP 分子结构，同时改变酶对蛋白质分子作用肽链长度和分子质量，由于机械力和空化气泡产生的作用力不断改变化学键，将MOWP 分子内部基团暴露，改变酶切位点，致使段肽链变为长肽链，则亚基分子质量增加。胃消化的SDS-PAGE 图谱中还可发现经消化后酶解液含有两条亚基条带，可能是一条多肽链中含有部分二硫键，经β-巯基乙醇分解后产生两条肽段，也有可能是胃消化直接产生两条具有显著分子质量差异的多肽片段；
胃肠连续消化的SDS-PAGE 图谱中仅有一条亚基条带，也证实胃肠酶连续消化后肽段不含二硫键。
2.4 超声功率对MOWP 消化产物内源荧光的影响
经模拟胃消化和胃肠连续消化两阶段后，内源荧光峰值波长发生偏移，如图4所示，胃肠连续消化峰值波长大于胃消化峰值波长，并且两处消化阶段内源荧光最大峰值（λmax）均大于330 nm，以此推断经过胃消化的MOWP 与连续消化的MOWP 产生的肽段均处于极性环境中[24]，连续消化极性作用强于胃消化的极性作用。在连续消化中，超声预处理可改变荧光强度和峰值波长。其中经超声作用处理的MOWP 经胃消化后消化产物内源荧光强度均降低，经胃肠连续消化后消化产物内源荧光强度均增强；
超声功率大于40%时在两处消化中的荧光波长均发生红移，胃消化的λmax由351 nm 红移至353 nm，胃肠连续消化由353 nm（MOWP）红移至356 nm（MOWP-80）处又降至355 nm。
图4 超声功率影响MOWP 的胃肠消化产物内源荧光图谱Fig.4 Ultrasonic power affects the fluorescence spectra of gastrointestinal digestive products of MOWP power
峰值波长红移原因可能分为两种：1）经超声处理的MOWP 会改变非共价作用力，多肽之间相连的化学键在声场冲击下不断断裂，不同多肽之间重写排列又形成新的化学键，依照化学键的改变多肽间末端氨基酸排列顺序也随之改变，经过胃消化或胃肠连续消化作用后，酶切作用生成不同分子质量亚基即峰值波长发生偏移；
2）经超声处理的MOWP 分子内部不断伸展，超声强度增强伸展程度，酶切位点暴露程度不同导致峰值波长发生偏移。
2.5 超声功率对MOWP 消化产物抗氧化活性的影响
2.5.1 DPPH 自由基清除率 经超声处理的MOWP 在胃消化和两步消化后的DPPH 自由基清除率与未处理样品相比具有显著性差异（P＜0.05）。如图5所示，经胃蛋白酶酶解后超声作用的MOWP 清除能力显著增强，上升至（78.26±0.85）%；
然而，随着超声功率增强，在MOWP-100 处降至（41.34±6.66）%。在胃肠消化水解后DPPH 自由基清除率相较胃消化显著降低，MOWP-60 经酶解后虽降低至（44.23±0.98）%，但优于未处理MOWP。
图5 超声功率对MOWP 胃肠消化产物DPPH 自由基清除活性的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of DPPH free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP
已有研究表明超声作用蛋白质可显著提高改性蛋白质酶解产物抗氧化活性[25，27-28]。本文中40%～60%超声功率条件下的超声波机械和空化作用在最大程度延展分子内部化学键的同时暴露部分具有单电子和强电荷量的氨基酸，并且酶的作用位点根据超声强度而偏移，经胃蛋白酶消化后含有该类氨基酸的多肽游离于溶液中，与DPPH 反应后暴露的单电子氨基酸与其相结合，DPPH 自由基清除率增强。随着连续消化的进行，游离氨基酸增多，含有单电子和强电荷量氨基酸的多肽含量减少，自由基清除效果减弱。Santos 等[29]探究辣木籽水溶性凝固剂凝固血液效果中发现水提取完整辣木籽得到的凝固剂具有一定DPPH 自由基清除能力，正是由于辣木籽中含有抗氧化性多肽，胃肠消化增强其抗氧化能力所致。
2.5.2 ABTS 自由基清除率 如图6所示，未处理MOWP 与前期超声处理的MOWP 在胃消化和胃肠连续消化中清除ABTS 自由基能力呈现相反趋势，经胃消化酶解后清除ABTS 自由基能力随超声功率呈现先减小后增大趋势，MOWP-40 处降至最低为（6.45±0.75）%；
模拟胃肠连续消化后MOWP 的清除ABTS 自由基能力显著（P＜0.05）上升，MOWP-100 的ABTS 清除值升至（91.87±0.19）%。
图6 超声功率对MOWP 的胃肠消化产物ABTS 自由基清除率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of ABTS free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP
Zou 等[20]在研究中指出ABTS 试剂是一种具有显色基团的化合物，该化合物极易与疏水基团或氨基酸结合。在先前的研究中[19]，MOWP 经不同超声功率处理后表面疏水指数显著降低。结合ABTS 试剂作用基团或氨基酸种类，提示在胃消化后大量小分子质量多肽暴露更多的亲水基团，ABTS 自由基清除率降低。进入模拟小肠消化阶段，酶解作用增强，酶解程度增加，被包埋的疏水基团或者氨基酸逐渐分解、暴露，ABTS 自由基清除率增大。
2.5.3 羟自由基清除率 当前研究表明羟自由基在生物体内具有杀死红细胞、降解DNA、降解多糖化合物等多重恶性效应[30]。图7所示，胃消化酶解与肠消化酶解对未处理MOWP 影响较大，在胃蛋白酶酶解后羟自由基清除能力较强为（97.15±0.93）%，继续模拟小肠酶解降低至（63.53±0.50）%。经胃消化后，随着超声功率的增大，超声波作用显著降低（P＜0.05）MOWP 的酶解多肽对羟自由基的消除能力；
而进入胃肠连续消化，MOWP的酶解多肽对羟自由基的消除能力显著增强（P＜0.05），MOWP-80 的清除值（96.53±1.35）%。
图7 超声功率对MOWP 的胃肠消化产物羟自由基清除率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic power on scavenging activities of OH free radical in gastrointestinal digestive products of MOWP
超声作用后，随功率增大（20%～80%），经胃肠连续酶解后的MOWP 与羟自由基结合位点暴露程度增强，清除能力增加。超声功率为60%时，胃消化酶解与肠消化酶解后的羟自由基清除率无显著变化，这可能是由于与羟自由基结合的位点在胃蛋白酶酶解后已完全暴露，多数含有结合位点的多肽与羟自由基结合，清除数值无明显变化。降低羟自由基含量对抗衰老具有积极意义，超声作用增强了人体消化MOWP 的过程中对羟自由基清除效果。
2.5.4 Fe2+螯合力的影响 如图8所示，该图为前期不同超声功率处理对MOWP 消化产物金属鳌合力的影响。图中胃消化后MOWP 的Fe2+鳌合能力均高于胃肠连续消化，并且不同功率的超声作用均使酶解后多肽的鳌合力高于原蛋白。然而，进一步的研究发现模拟小肠深度酶解后Fe2+鳌合能力低于胃水解，最高值仅为（22.90±1.06）%（MOWP-80），未处理MOWP 降低至（2.54±0.58）%。
图8 超声功率对MOWP 的胃肠消化产物Fe2+螯合力的影响Fig.8 Effect of ultrasonic power on Fe2+ chelating force in gastrointestinal digestive products of MOWP
根据MOWP 消化率和水解度测定结果，胃蛋白酶水解后酶解液中含有少量完整蛋白质分子和大量多肽，Fe2+与蛋白质或多肽结合形成螯合物可降低自由基氧化速率并阻止Fe2+进一步催化[31-32]。含有胰蛋白酶的小肠液进一步分解蛋白质和多肽，切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中侧链羧基，解离成更多游离氨基酸，对Fe2+作用能力较小，鳌合力降低。对比蛋白质和多肽对金属鳌合能力，陈梦霏等[33]在研究蛹虫草抗氧化活性时做出分析，发现多肽对金属离子螯合能力优于蛋白质，并随浓度增加而增强。本文中正是由于经胃水解产生大量多肽加强Fe2+螯合能力，前期超声作用增加胃蛋白酶酶切位点，解离更多具有螯合能力的多肽，进一步增强Fe2+螯合力。
本研究表明MOWP 经模拟胃肠消化的消化产物的消化率、水解度和荧光峰值波长随着超声功率的增强而增加。在模拟人体消化过程中，超声处理使MOWP 增强分子内部延展，并改变化学键与分子间作用方式。超声处理的MOWP 在胃消化阶段生成较多多肽，显著增强消化产物的DPPH自由基清除力和Fe2+螯合力；
模拟小肠进一步水解后生成较多游离氨基酸，则增强ABTS 自由基清除力和羟自由基清除力。