彭秘，张增珠，李刚，苏丹，熊国营，刘匡一*（. 中国人民解放军联勤保障部队第908医院，南昌 0000；
. 江西中医药大学抑郁症中医证候动物模型江西省中医药管理局重点研究室，南昌 0000；
. 南昌市第一医院，南昌 0000）
女性更年期综合征（绝经前后诸证）中医辨证属肝肾阴虚证，症见烘热汗出、头晕、耳鸣、腰膝酸软或足跟痛、少寐多梦、急躁易怒等，关黄母颗粒在临床上常应用于妇女更年期后抑郁症类疾病的治疗，其主要成分包括熟地黄、龟甲胶、盐关黄柏、盐知母以及白芍。目前临床对抑郁治疗的药物多为化学类精神药品，普遍存在副作用大，成瘾性隐患等问题。近年来，愈来愈多的药学科研人员将目光转移至传统中药上来，以五味子、白芍、关黄柏等药材为主要代表。相对于关黄柏等单味药材，已有文献表明知母与关黄柏配伍联用可显著提高其小檗碱等生物碱的含量[1]，而关黄母颗粒作为临床疗效确切的中药复方制剂，其具体联合用药抗抑郁作用机制尚不清晰，药物主要化学成分能否跨过血脑屏障直接调控神经系统成为传统中药治疗抑郁疾病的重要环节之一[2-3]，因此，对其主要化学成分的分析及脑组织移行成分的研究显得极为重要。
本实验利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-QTOF/MS）中的IDA采集技术[4-7]，结合数据库及文献资料，解析药物中可能存在的主要化学成分，并鉴定大鼠灌胃给药后药物的入脑成分，为进一步明晰该药物抗抑郁作用物质基础提供实验依据[8]，也为下一步的药物质量控制研究奠定基础。
1.1 仪器
ExionLC AD超高效液相色谱系统、SCIEX X500R 四极杆飞行时间质谱仪（美国SCIEX）；
高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；
涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；
分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；
恒温氮气吹干仪（青岛海科仪器有限公司）。
1.2 试药
红景天苷（批号：B1619137，纯度≥97.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），槲皮苷（批号：111538-200301，纯度≥94.5%，中国食品药品检定研究院），益母草苷（批号：YA220607，纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）。甲醇、乙腈（色谱级，Thermo Fisher公司），甲酸（质谱级，美国Sigma公司）。蒸馏水采用屈臣氏蒸馏水。关黄母颗粒（批号：04210503，通化万通药业股份有限公司，每袋装9 g，相当于饮片4.8 g）。
2.1 药液样品的制备
取1袋药品（相当于饮片4.8 g），移至100 mL烧杯中，加入80%乙腈水溶液50 mL，超声30 min，取适量超声提取液，16 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样分析。
灌胃药液：取1袋药品，用25 mL蒸馏水溶解完全，现配现用。
2.2 对照品溶液的制备
取红景天苷、槲皮苷及益母草苷对照品溶液适量，乙腈溶解稀释，混合配制成为终质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液，4℃冷藏保存。
2.3 动物实验
SPF级雄性SD大鼠4只，体质量（180±20）g [江西中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（赣）2018-003]。正常喂养1周后开始实验，给药前禁食12 h，自由饮水，空白组灌胃2.5 mL蒸馏水，实验组灌胃2.5 mL灌胃药液，3只大鼠分别于灌胃后1、2、4 h剥离大鼠脑组织，生理盐水冲洗，洗净后加入2倍于组织重量的生理盐水溶液于匀浆机上处理，匀浆后样本4000 r·min-1离心5 min，取上清液至-20℃保存。
2.4 血浆及组织样品前处理
取各时间点大鼠脑匀浆后上清组织液200 µL，600 µL乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡2 min，16 000 r·min-1离心10 min，取上清液，室温下氮气恒流吹干，200 µL乙腈复溶，进样分析。
2.5 色谱条件
采用Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司）；
流动相：正离子模式下0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B），负离子模式下水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，5%B；
1～10 min，5%～15%B；
10～35 min，15%～65%B；
35～38 min，65%～95%B；
38～41 min，95%B；
41～41.1 min，95%～5%B，41.1～45 min，5%B）；
流速：0.3 mL·min-1；
柱温：40℃；
进样体积：2 µL。
2.6 质谱条件
ESI正负离子扫描，喷雾电压+5500 V/-4500 V。Gas 1/Gas 2 55 psi；
Cur Gas 35 psi；
一级TOF MS扫描范围100～1500 Da，DP 65 V。IDA扫描模式下对碎片进行数据采集，CE ±35 V，MS/MS扫描范围50～1500 Da。采样全程DBS（动态背景扣除）模式下运行。
2.7 数据处理
使用SCIEX OS 2.0对数据进行处理，在Mass Error＜5×10-6内，鉴定药物中主要化学成分。
3.1 药液化合物分析结果
药液的总离子流图见图1。通过Sciex OS 2.0数据处理软件，结合数据库、对照品、部分文献[9-16]以及天然产物裂解规律，共鉴定出159个化学成分，包括萜类27个，生物碱22个，黄酮类20个，醇苷类11个，皂苷类13个，有机酸类12个，氨基酸类12个，木脂素类3个，其他类39个。具体结果见表1。
表1 正、负离子模式下样品的主要化学成分Tab 1 Main chemical compositions in samples in the positive and negative ion modes
续表1
续表1
续表1
图1 正（A）、负（B）离子模式下样品的总离子流图Fig 1 Chromatogram of samples in positive（A）and negative（B）ion modes
3.2 醇苷类化合物结构解析鉴定
样品中存在较多醇苷类化合物，以地黄苷为例，负离子模式下，保留时间23.07 min存在加和离子m/z651.2291 [M-H]-的信号强度，对应的IDA MS/MS碎片离子中存在m/z475.1821以及m/z193.0506和m/z175.0401特征峰，结合天然产物质谱裂解规律，推测m/z475.1821以及m/z193.0506可能为苷键断裂后产生的[M-C10H8O3-H]-及[M-C21H30O11-H]-的碎片离子，m/z175.0401为m/z193.0506脱去一分子水所得。
3.3 萜类化合物结构解析鉴定
在整个色谱结构解析过程中鉴定出大量的萜类化合物，实验通过m/z165.0557以及m/z121.0298特征碎片离子的方式来寻找化合物，结果主要以芍药苷、牡丹皮苷D、牡丹皮苷B、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷为主。以芍药苷为例，保留时间14.64 min存在加和离子m/z479.1564 [M-H]-的信号强度，同时产生m/z449.1449 [M-CH2O-H]-的碎片离子，并再次碎裂分解为m/z327.1078的一分子苯甲酸结构及脱去一分子苯甲酸的m/z327.1078的碎片离子[9]。
3.4 生物碱类化合物结构解析鉴定
共鉴定出22种含生物碱类结构的化合物。从峰面积响应强度上来看，含量较多的为黄柏碱、木兰花碱、药根碱、小檗碱以及巴马汀。该类化合物大多都含有m/z308.1275以及m/z294.1120特征碎片离子。以药根碱为例，tR20.23 min出现m/z338.1379以[M]+的一级信号，二级质谱图中m/z323.1145为[M-CH3]+所致碎片离子，m/z322.1068则为m/z323.1145结构中含氮的闭合环上发生电子重排反应再次失去H分子产生双键所得，m/z308.0915[M-CH3-CH3]+则可能是m/z338.1379母离子失去两分子甲基后的电子重排的双键产物[14]，m/z294.1120则是m/z322.1068裂解失去CO所得。具体二级质谱图及裂解方式见图2。
图2 药根碱二级质谱图及可能存在的裂解途径Fig 2 MS spectrogram of jatrorrhizine and possible cracking pathways
3.5 黄酮类化合物结构解析鉴定
通过文献检索、数据库以及天然产物裂解规律，结合数据处理软件中Formula Finder确证方式，正离子扫描模式下共鉴定出以[M+H]+加和方式存在的槲皮素、芒果苷、新芒果苷以及牡荆苷等20种黄酮类化合物。在天然产物裂解规律中，黄酮类物质一般带有糖基类基团，失去糖基后结构易再次发生RDA裂解反应。以tR17.51 min金丝桃苷为例，二级碎片离子包括失去一分子葡萄糖基的m/z303.0499以及经RDA等裂解反应终得的m/z85.0284碎片离子。其中m/z303.0499、m/z85.0284的碎片离子是芦丁、金丝桃苷的共有特征碎片离子，m/z301.0363是汉黄芩苷黄酮化合物的特有碎片离子[16]。
整合裂解规律，黄酮类化合物在整体二级质谱裂解过程中C环1位和4位上的CO键易脱去，产生新的碎片离子。以tR13.73 min槲皮素为例，m/z303.0499是槲皮素的[M+H]+一级信号，失去一分子水得二级碎片信息中m/z285.0411，再次发生缩合反应失去一分子CO得到m/z257.0452碎片离子[16]。
3.6 皂苷类化合物鉴定
共鉴定出13种皂苷类成分，主要以知母皂苷A2、知母皂苷AⅢ及知母皂苷BⅡ为主。以tR26.88 min知母皂苷BⅡ为例，m/z919.4895的[M-H]-离子为其一级加和方式，m/z757.4353为[M-C6H10O5-H]-碎片离子，m/z595.3787为[M-C12H20O10-H]-碎片离子，具体二级质谱图及可能裂解途径见图3。
图3 知母皂苷B Ⅱ二级质谱图及可能存在的裂解途径Fig 3 MS spectrogram of timosaponin and possible cracking pathways
3.7 脑组织样本分析结果
根据以上鉴定结果，对大鼠灌胃给药后1、2、4 h脑组织样本进行UPLC-QTOF/MS鉴定分析，通过色谱图和碎片离子信息共推测出15种入脑成分，并结合Sciex QTOF中的Swath非数据依赖型采集技术，选择目标化合物中MS/MS响应强度大的二级碎片离子形成MRMHR（High Resolution）通道进行定量研究。结果显示，组织样品中含量较高的部分主要为关黄柏中生物碱类成分，以小檗碱、巴马汀、小檗红碱为代表，其次是芍药苷类化合物，例如芍药苷、芍药内酯苷等。在其中4 h脑组织样本中检测出京尼平苷酸类熟地黄化合物，含量较小。生物样品移行成分峰面积分布见图4。
图4 不同大鼠1 h、2 h及4 h脑组织移行成分峰面积Fig 4 Peak area content of migrating components in different brain tissues at 1 h，2 h and 4 h
本实验基于UPLC-QTOF/MS分析方法对关黄母颗粒中主要化学成分进行了分析研究，推测出可能存在的159种主要化学成分。其中共鉴定出关黄柏类化合物39种，熟地黄类36种，盐知母类化合物26种以及白芍类化合物35种，其中以盐关黄柏中生物碱及白芍中萜类成分最多，并通过动物实验成功鉴定出15种入脑成分。
在色谱柱选择方面，本实验着重比较了C18与T3两种色谱柱的分离情况，颗粒中主要成分为水溶性，C18色谱柱得到的色谱图大部分色谱峰聚集在保留时间前三分之一段，造成了IDA二级扫描模式下部分化合物二级碎片的缺失，因此，通过最终实践比较，选择了T3色谱柱进行分离实验。
从鉴定结果表1中可见，鉴定出大量的氨基酸类、腺苷类及嘌呤类物质，其在种类及含量上远超于知母、关黄柏、白芍及熟地黄等单味药材，考虑是颗粒剂中含有龟甲胶成分所致。通过脑组织样品化合物成分鉴定，发现以小檗碱、巴马汀、药根碱、小檗红碱、芍药苷、芍药内酯苷等化合物入脑含量较多。有文献表明，关黄柏类生物碱化合物能通过调节花生四烯酸、甘油磷脂等代谢通路达到消炎镇痛的效果，同时巴马汀成分具有抑制单胺氧化酶A，调节脑去甲肾上腺素、血清素、多巴胺水平的能力[13]。而白芍中大量的萜类成分，则具有神经系统调节的功效，芍药苷、芍药内酯苷等易透过血脑屏障的特点可能是关黄母颗粒剂中治疗抑郁样情绪障碍的有效成分[8]。与之相同的是，知母皂苷BⅡ作为样品鉴定中成分最多的皂苷类物质，在针对女性更年期抗抑郁方面也有一定的药理作用[17]。而熟地黄中黄酮类化合物则可以显著提高血清雌激素浓度、脾细胞雌激素受体含量水平[18]。
综上所述，本实验通过运用UPLC-QTOF/MS技术对关黄母颗粒主要化学成分及大鼠入脑成分进行了分离和鉴定，后续将对入脑成分在大鼠各脑组织（海马、下丘脑、大脑皮层、脑垂体、脑干等）中的分布进行研究，进一步分析15种入脑成分在各区域靶器官的含量，为明晰该制剂改善更年期综合征及抗抑郁等作用的物质基础提供参考。
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