傅琪彦 符秀娟 林丽珍 丁兆建
（1.海南职业技术学院 海南 海口 570216；
2. 琼台师范学院 海南 海口 571127）
我国特有的濒危药用植物降香黄檀，其树干和根的干燥心材是一味珍贵的传统中药降香，含有的主要成分为黄酮类化合物。众所周知，降香黄檀树龄达10年左右开始形成心材，转化速度慢，20~30年后才有一定收获价值；
但其一般5年就可开始结籽，之后每年均可收获，不像获取心材那样需要砍伐林木。降香黄檀籽在海南民间也像心材那样被普遍利用，具有降血压血脂、舒筋活血和镇痛消炎等功效，然而，对降香黄檀树籽中黄酮类成分的提取和利用的研究仍不多见。
本文应用超声波提取法，以降香黄檀树籽为研究对象，对其中黄酮类成分进行提取分离和测定，研究提取工艺参数如乙醇浓度、溶剂用量、超声作用时间、提取温度和提取次数对提取得率的影响，探索一种快速简便的降香黄檀籽黄酮提取方法，挖掘降香黄檀的应用价值，为其开发利用提供科学依据，从而有效保护海南降香黄檀的林木资源。
实验用的降香黄檀树籽在海南省屯昌县采集，挑选其中粒大饱满完好无损的树籽，烘箱烘干后整理，然后粉碎过60目筛，粉末在4℃环境密封保存。
主要仪器：普析UV-1810APC紫外可见分光光度计、SDO-1018T超声波发生器、BL-200型高速多功能粉碎机、TDL-50B型 台式离心机、DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱。
药品：芦丁（标准品），95%乙醇（分析纯）、硝酸铝、亚硝酸钠等。
2.1 提取工艺
将上述得到的降香黄檀籽粉末浸泡到不同浓度、不同溶剂用量倍数的乙醇溶液中，不同温度下水浴加热于超声波发生器中，进行不同功率和时间的超声波作用，所得溶液用离心机在4000r/min条件下作用15分钟，上清液抽滤后，定容得到所需的提取液。
2.2 降香黄檀籽中含有黄酮类化合物的确定
取 1.0g 降香黄檀籽粉末，加入95%乙醇25.0mL在65℃中超声提取30min，离心后取适量的上清液于两支试管中，分别进行盐酸-镁粉反应和三氯化铁反应，看是否有黄酮类化合物的特征显色反应。降香黄檀籽醇提取液加入盐酸-镁粉后显红色，加入 5%三氯化铁醇溶液后出现深褐色沉淀，表现出明显的黄酮类化合物的特征颜色反应。对照试验排除了假阳性。
2.3 分光光度计波长范围的确定
用 50%乙醇溶解精确称取的20mg 芦丁标准品，定容至 100mL，得到 200µg/mL 的芦丁标准溶液。另在50mL 50%乙醇中加入3.00g 降香黄檀籽粉末，于65℃超声提取30min，离心后取上清液，再重复将滤渣层提取一次，合并两次提取液，定容至 100mL。
取上述 1.0mL芦丁标准溶液和 1.0mL 降香黄檀籽提取液，分别加入0.3mL 5%NaNO2溶液，摇匀后静置 6min，加入 0.3mL 10% Al（NO3）3溶液，再摇匀后静置6min，加入 4.0mL 4%NaOH 溶液，50%乙醇定容至 10mL，放置10min，用分光光度计测量460～550nm范围内的吸光值。
结果表明，在碱性条件下芦丁和降香黄檀籽黄酮提取液与NaNO2-Al（NO3）3-NaOH生成红色铝螯合物，其在510nm波长附近都有最大吸收峰。实验发现，上述供试品的吸光值在30min内较稳定，之后吸光值下降较快。为得到稳定可靠的吸光值，本实验在加入显色剂10min内测定，选取测定的吸收波长为 510nm。
2.4 标准曲线的绘制
取2.3节中配制的芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分别置于不同的10mL容量瓶中，然后依次加入0.3mL 5%NaNO2溶液、0.3mL 10%Al（NO3）3溶液，最后再加入4.0mL 4%NaOH 溶液，每种溶液加入后均需摇匀并静置 6min再加入后一种溶液，最后用50%乙醇定容至刻度，摇匀放置 10min。
准备好的样品用分光光度计在 510nm波长处测吸光度，以空白溶液为参比，作芦丁浓度-吸光度标准曲线（见图 1），得回归方程y=0.0112x-0.0003，R2=0.9982。式中y为吸光度A值，x为芦丁浓度C（μg/mL），测定范围为 10～60μg/mL。
图1 芦丁浓度与吸光度标准曲线
2.5 原料中总黄酮得率的测定 方法
为了测定降香黄檀籽中黄酮（包括黄酮 、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇、双黄酮等）的总含量，可使黄酮结构中相邻羰基、羟基与金属离子络合而显色，根据显色深浅，即吸光度A值大小，依据芦丁标准品曲线建立的回归方程，计算总黄酮含量。
精密称取5.0g降香黄檀籽样品粉末，浸泡于一定浓度乙醇溶液60min，而后在水浴中进行超声波提取，离心，上清液减压抽滤，收集滤液，用50%乙醇溶液定容，制得供试品溶液，测其在510nm吸收波长下吸光度A。用2.4节的芦丁标准曲线回归方程计算供试品溶液中总黄酮浓度C（µg/mL），从而计算超声波辅助提取降香黄檀籽粉末中总黄酮得率W %。
式中：W%—供试品中提取总黄酮的得率（%），C—供试品溶液中总黄酮的浓度（µg／mL），n—稀释倍数，V—供试品溶液定容体积（mL），m—降香黄檀籽粉样品的质量（g）。
运用单因素试验法研究影响得率的工艺关键参数，测量了各参数与总黄酮提取得率的关系。称取5.0g降香黄檀籽样品粉末，固定其他条件，分别考 察单因素，如乙醇浓度（20%、40%、50%、60%和80%）、样品粉末 与 溶 剂 用 量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）、超声波功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）、超声作用时间（10、20、30、40和50min）、提取温度（35、45、55、65、75℃）和提取次数（1-3次）对总黄酮得率的影响。
3.1 乙醇浓度的影响
在固定其他条件时，分别考察影响总黄酮得率的关键单因素乙醇浓度（20%、40%、50%、60%和80%），按照2.5节的方法操作，计算得率。
由图2可见，随着乙醇浓度从20%逐步增加，降香黄檀籽总黄酮的得率也快速增加，得率最大值对应的乙醇浓度为60%；
当乙醇浓度继续增加并升至70%时，总黄酮提取得率反而缓慢降低。因此选定60%乙醇作为降香黄檀籽总黄酮的最佳提取溶剂浓度。分析原因认为主要是提取溶剂极性发生变化造成的影响，根据相似相溶原理，只有在一定的极性即合适的乙醇和水的混合比例下，黄酮类成分才能比较充分地溶解出来。
图2 乙醇浓度对提取降香黄檀籽总黄酮得率的影响
3.2 提取溶剂用量的影响
在固定其他条件时，分别考察样品粉末与溶剂用量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）与降香黄檀籽总黄酮得率的关系。
随着溶剂用量从10倍逐步增加，总黄酮的得率也快速增加，得率最大值对应的溶剂用量为25倍；
当溶剂用量继续增加并达到30倍，总黄酮得率仍有所提高。通常认为，提取过程中乙醇溶剂量越大，有效成分越能充分溶解，因此提取量也越大。图3中当溶剂用量大于30倍，得率曲线趋缓并形成平台，是因为此时有效成分的溶解和扩散已达到平衡，增加乙醇溶剂不会增加有效成分的溶解，反而是增加了溶剂成本以及后续工艺中提取液的过滤浓缩和溶剂回收难度。当选定60%乙醇作为降香黄檀籽总黄酮的最佳提取剂浓度时，最佳溶剂用量选择为25倍。
图3 提取温度对黄酮得率的影响
3.3 超声功率的影响
固定其他条件时，分别考察超声功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）与降香黄檀籽总黄酮得率的关系。
当功率在120W到180W之间变化时，得率在一定范围内波动，趋势变化不大，说明超声功率的大小对黄酮得率的影响不大。可以选取较低的120W常见功率进行提取。
3.4 超声作用时间的影响
在固定其他条件时，分别考察超声作用时间（10、20、30、40和50min）与降香黄檀籽总黄酮得率的关系。
当提取时间从10min增加至 30min 时总黄酮得率显著提高，当提取时间超过30 min后总黄酮得率曲线显示出缓慢变化的平台。与溶剂用量增加的变化规律相似，当提取时间超过30min 后，黄酮类化合物在料液之间的传递基本达到动态平衡，继续增加提取时间不会有更多有效成分析出，因而得率增加的效果不大。综合考虑总黄酮的得率及提取时间成本，降香黄檀籽总黄酮的最佳提取时间选定为30min。
3.5 提取温度的影响
在固定其他条件时，分别考察提取温度（35、45、55、65、75）与降香黄檀籽总黄酮得率的关系。
图3可见，提取温度对总黄酮得率影响较大的温区在35℃至65℃之间，此时随温度提升总黄酮得率提高得较快，但温度超过65℃之后提取效果的增加就不大明显了。因为，适当高的温度可以促进植物组织软化和膨胀，蛋白质和酶易被破坏和凝固，增加有效成分的溶解及扩散速度，有利于有效成分的提取。但温度过高，会造成料液中一些热不稳定成分的氧化和破坏。对比数据可以认为，降香黄檀籽总黄酮的最佳提取温度为65℃左右。
3.6 提取次数的影响
在固定其他条件时，分别考察提取次数（1~3次）与降香黄檀籽总黄酮得率的关系。结果表明，要获得较高的降香黄檀籽总黄酮得率，需要进行至少2次提取。第1次的得率为 3.12%，原料中剩余的黄酮类成分还较多；
在第2次提取时得率达到 3.64%，此时原料中黄酮类成分已剩余不多。而提取3次时总黄酮得率几乎没有太多增加。因此，选定降香黄檀籽总黄酮的最佳提取次数为2次。
对海南降香黄檀（黄花梨）树籽中总黄酮含量进行超声波辅助提取的优化测试，运用单因素试验法获得了提取工艺的关键参数。实验中采用紫外分光光度计，以芦丁作标准品，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作显色剂，建立了降香黄檀籽总黄酮含量的简易测定方法。运用单因素试验法获得优化的关键工艺参数为：乙醇浓度为 60%、溶剂用量为25倍、提取时间为3 0min、提取温度为65℃、提取次数 2次。在这一条件下，降香黄檀籽总黄酮的最高得率能达到 3.64%。查询文献，不同来源的降香总黄酮含量为2.51%~5.82%。因此，与降香黄檀心材相比，黄酮含量较高的降香黄檀籽是一种未被利用的原料，其黄酮类化合物需要进一步研究以便开发利用。
超声波辅助提取具有高效、节能和工艺简单的优点，充分利用总黄酮含量较高的降香黄檀籽，将有利于提升对海南降香黄檀林木资源的保护。
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