赵爱月，苏云霞，傅德强
（福建医科大学 附属第二医院 肿瘤内科，福建 泉州 362000）
卵巢癌是女性最常见恶性肿瘤之一，其临床治疗尚无重大突破性进展，5年生存率保持在25%～35%［1］。虽然肿瘤免疫治疗在多个瘤种已显示出令人振奋的治疗前景［2-4］，并部分应用于卵巢癌治疗领域，但仍然缺乏对卵巢癌的精准的疗效预测指标。
肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）的格局直接影响化疗和肿瘤免疫治疗的转归，与肿瘤患者预后密切相关［5-6］。CD8 T细胞浸润预示卵巢癌患者预后良好［7-8］，而瘤内调节性T细胞（regulat T cell，Tregs）［7，9］或中性粒细胞［10］浸润提示预后不佳。细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4／CD80分子（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4／CD80 molecule，CTLA-4／CD80）和程序性细胞死亡分子1／程序性死亡配体1（programmed cell death 1／programmed death ligand 1，PD-1／PD-L1）等免疫共信号通路主导免疫细胞的功能状态，在肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用［11］。近年来有研究基于免疫相关基因的表达水平评估TIME格局和预测肿瘤患者的预后［11-13］，但是具体机制尚未完全明朗。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是内源性非编码RNA，通常由20～25个核苷酸组成。miRNAs可降解或抑制翻译调控靶基因表达［14］，参与多种肿瘤疾病的发生、发展［15］，对TIME具有调控作用。Wang等［16］在小鼠肺癌模型中发现miRNA424可以下调肺癌细胞PD-L1表达。另一项研究表明，let-7b可通过下调CD8 T细胞PD-1表达和肺癌细胞PD-L1表达来重塑TIME［17］。De Mattos-Arruda等［18］报道miRNA21可通过激活IL-6／STAT3／NF-κB和PI3K通路改变乳腺癌TIME格局。在卵巢癌中，miRNA92［19］、miRNA145［20］、miRNA424［21］等可通过不同机制上调或下调PDL1表达并改变TIME格局。然而，介导TIME形成的关键miRNA仍不清楚。
本研究以癌症基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA）和高通量基因表达（gene expression omnibus，GEO）数据库为数据来源，拟通过生物信息学方法来筛选卵巢癌关键miRNAs及相关基因，探讨其对肿瘤免疫格局和预后的影响，阐明潜在的机制。
1.1 数据采集与预处理
所有卵巢癌患者数据均来源于TCGA（https：／／portal.gdc.cancer.gov／）和GEO（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）。以TCGA数据集作为训练队列，以GEO数据集（GSE30161、GSE32062和GSE63885）作为验证队列。对所有数据进行归一化处理，使用“sva”R包去除GEO数据集的批间误差。排除总生存时间（overall survival，OS）小于1个月的患者。最终，TCGA数据集共纳入294例卵巢癌患者资料，GEO数据集共纳入393例卵巢癌患者资料。选择GSE129880、GSE117007和GSE119056数据集验证hsa-mir-7702与TIME的相关性。数据采集流程和分析均遵守TCGA和GEO的所有规定。
1.2 生物信息学分析
根据卵巢癌患者疗效与OS的线性相关性，通过“surv_cutpoint”函数计算获得PD-L1表达最佳阈值；
采用“survival”和“survminer”包进行生存差异分析；
利用“limma”包筛选差异表达基因（differentially expressed gene，DEGs），并以P＜0.05，｜logFC｜（即｜log2FC｜）＞0.5作为选择条件进行后续分析。通过ESTIMATE算法评估TIME格局，包括基质细胞和免疫细胞［22］。根据Bindea等［23］提供的数据集，采用单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法评估免疫细胞浸润和免疫相关通路富集水平。基于拓扑重叠矩阵，采用权重基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）进行平均连锁聚类，分析某些疾病基因表达的相关性，根据基因的权重、连接度和相关系数筛选关键基因［24］。利用STRING 数据库（https：／／www.string-db.org／）［25］分析蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）。利用“clusterProfiler”软件包对关键基因进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析［26］。
1.3 关键基因的鉴定
Pearson相关性分析获得DEGs（包括miRNAs和mRNA）相关系数并以P＜10-8，｜logFC｜≥0.5，频次＞100为条件筛选重要DEGs，以Cor＞0.5，P＜0.05为条件筛选重要miRNAs，即hsa-mir-7702及其相关基因。根据WGCNA结果，选择蓝色模块中连接度Top100与PD-L1相关性Top100的基因交集，即权重基因。根据图1所示流程，筛选出关键基因。
图1 关键基因筛选流程图Figure 1 Flowchart of hub-genes identification
1.4 统计分析
应用R4.0.2软件进行统计分析，使用limma数据包中的Student t检验方法筛选DEG。KEGG中选择差异有统计学意义（P＜0.05）的信号转导通路进行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比较采用log-rank检验。连续变量采用t检验计算比较，分类变量通过χ2检验分析（n＜5时行连续校正χ2检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 临床特征
本研究所有患者数据均来自TCGA和GEO数据库。TCGA数据库共294例卵巢癌患者资料作为训练队列；
GEO数据库共393例卵巢癌患者资料作为验证队列，包括GSE30161数据集58例，GSE32062数据集260例，GSE63885数据集75例。卵巢癌患者的临床特征见表1。
表1 TCGA和GEO队列卵巢癌患者临床特征Table 1 Clinicopathological characteristics of patients w ith ovarian cancer in TCGA cohort and GEO cohort
2.2 卵巢癌患者PD-L1表达最佳阈值
基于卵巢癌患者OS和生存状态，计算获得PD-L1表达阈值（即第60百分位数）。根据PDL1表达阈值将所有患者分为高表达组和低表达组，生存分析结果表明，相比低表达组，高表达组具有显著生存优势（P＝0.004，图2A）；
在疗效方面两组未见明显差异。卵巢癌患者疗效与OS存在明显线性相关（OR＝0.68，图2B）。因此，基于OS和疗效计算并获得PD-L1表达最佳阈值为1.316，即第90百分位数。根据最佳阈值分组，高、低表达组在生存（P＝0.018，图2C）和疗效（P＝0.006）方面均具有显著差异。验证队列分析结果显示，与低表达组比较，高表达组表现出显著生存获益（P＝0.019，图2D）。
图2 卵巢癌肿瘤组织PD-L1表达最佳阈值与生存的关系Figure 2 The relationship between the optimal cutoff point of PD-L1 expression and the survival in ovarian cancer patients
2.3 PD-L1表达最佳阈值对卵巢癌TIME的评价作用
ssGSEA分析结果显示，与低表达组相比较，高表达组免疫细胞浸润更为显著，包括CD8 T细胞（CD8 positive T cells，CD8+T cells）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）、T辅助细胞（T helper cells）、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、活化树突状细胞（activated dendritic cells，aDCs）、未成熟 树突状细胞（immature dendritic cells，iDCs）、中性粒细胞（neutrophils）、巨噬细胞（macrophages）、自然杀伤细胞（natural killer cells，NK cells）、浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）（图3A）；
高表达组免疫细胞功能更强，包括免疫检查点（check point）、T细胞共抑制（T cell co-inhibition）、T细胞共刺激（T cell co-simulation）、抗原呈递细胞共刺激（antigen-presenting cell co-simulation，APC cosimulation）、细胞溶解活性（cytolytic activity）、主要组织相容性复合体I类分子（major histocompatibility complex class I，MHC class I）、CC轴趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR）、I型干扰素反应（type I IFN reponse）、炎症刺激（inflammation promoting）、副炎症（parainflammation）和抗原呈递细胞共抑制（antigen-presenting cell co-inhibition，APC co-inhibition）（图3B）。ESTIMATE分析结果表明（图3C），与PD-L1低表达组比较，PD-L1高表达组具有较高免疫细胞评分（P＜0.001）和ESTIMATE评分（P＜0.001）。验证队列基于ssGSEA和ESTIMATE分析获得类似结论（图3 D-F）。
图3 PD-L1表达对卵巢癌肿瘤免疫格局的影响Figure 3 The effect of PD-L1 expression on tumor immune profile in ovarian cancer
2.4 DEGs的筛选结果
差异表达基因分析结果表明，共840个基因筛选为DEGs（｜logFC｜＞0.5，P＜0.05），其中，549个DEGs显著上调，291个基因显著下调（图4A）。基于DEGs的Pearson相关性分析，筛选出101个重要DEGs（P＜10-8，｜log FC｜≥0.5，频次＞100，图4B）。
图4 差异表达基因分析筛选Figure 4 The identification of DEGs
2.5 DEGs的WGCNA结果
840个DEGs的WGCNA结果（cut height＝650，β＝4，R2＝0.9，图5 A-C）表明，有646个DEGs的蓝色模块与PD-L1表达高度相关（Cor＝0.78，P＝3.2×10-133，图5D-E）。
2.6 hsa-m ir-7702选择和关键基因筛选
按照图1所示流程，根据DEGs相关性分析和WGCNA结果，筛选重要miRNA和关键基因。101个重要DEGs的Cytoscape分析表明，hsa-mir-7702和75个相关DEGs具有重要作用（Cor＞0.5，P＜0.05，图6A）。WGCNA结果显示，蓝色模块中基因连接度和PD-L1相关性Top100基因交集后筛选出48个权重基因。7个PD-L1表达相关的miRNA分析表明，hsa-mir-7702具有较高基因连接度（connectivity＝15.37），与PD-L1表达具有显著相关性（Cor＝0.48，-lg P＝17.56，图6B）。因此，选择 hsa-mir-7702作为关键miRNA，同时筛选出202个hsa-mir-7702相关基因（Weight≥0.3）。
图6 hsa-mir-7702和关键基因筛选Figure 6 Identification of hsa-mir-7702 and hub genes
进一步分析表明，46个基因共存于重要DEGs和权重基因，即DEG-WGCNA基因；
30个基因共存于hsa-mir-7702相关DEGs和hsa-mir-7702相关基因，即hsa-mir-7702互作基因。DEGWGCNA基因和hsa-mir-7702互作基因交集分析获得15个关键基因，包 括 TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，携有Ig和ITIM 结构域的T细胞免疫受体）、IL2RG（interleukin 2 receptor subunitgamma，白介素2受体γ亚基）、ICOS（inducible T cell costimulator，诱导T细胞共刺激因子）、SH2D1A（SH2 domain containing 1A，携有1A 的SH2域）、SLAMF6（SLAM family member 6，SLAM 家族成员6）、GZMA（granzyme A，颗粒酶A）、P2RY10（P2Y receptor family member 10，P2Y受体家族成员10）、SLAMF8（SLAM familymember 8，SLAM家族成员8）、CD247（CD247 molecule，CD247分子）、PDCD1LG2（programmed cell death 1 ligand 2，程序性细胞死亡1配体2）、CYTIP（cytohesin 1 interacting protein，细胞蛋白1相互作用蛋白）、RHOH（ras homolog family member H，ras同源家族成员H）、LCK（LCK proto-oncogene，LCK原癌基因）、STX11（syntaxin 11，突触融合蛋白11）和CXCR6（C-X-Cmotif chemokine receptor 6，CX-C轴趋化因子受体6）（图6C）。
2.7 hsa-m ir-7702在卵巢癌TIME的作用
根据hsa-mir-7702表达中位值将卵巢癌患者分为高表达组和低表达组，无监督聚类分析结果表明，与低表达组相比较，高表达组展现出更显著免疫细胞浸润和更强的免疫应答能力（图7A）。验证队列包括GSE119056、GSE115019和GSE129880数据集中，也有类似现象（图7B）。
图7 hsa-mir-7702表达对卵巢癌肿瘤免疫格局的影响Figure 7 Tumor immune profile in high-and low-expression groups according to median of hsa-mir-7702 in TCGA cohort and validation cohort
2.8 关键基因功能富集和PPI分析
KEGG分析表明，关键基因主要涉及免疫相关信号通路，包括PD-L1表达和PD-1检查点通路、自然杀伤细胞介导细胞毒作用、T细胞受体信号通路（图8A）。GO分析表明，关键基因主要介导免疫相关生物学功能（图8A）。其中，主要生物学过程（biological processes，BP）包括细胞-细胞黏附、T细胞活化正调控和T细胞共刺激；
主要细胞成分（cellular components，CC）包括质膜外侧面结构和免疫突触；
主要分子功能（molecular function，MF）包括C-C趋化因子结合、C-C趋化因子受体活化、T细胞受体结合、免疫受体活化等。PPI分析结果显示，15个关键基因与PD-L1存在直接或间接的相互作用（confidence＝0.6，图8B）。
图8 关键基因的功能富集分析和PPI分析Figure 8 Function analysis and PPIanalysis of15 hub genes
2.9 关键基因的生存分析
根据关键基因表达中位值分为高、低表达组，生存分析结果表明，训练队列6个关键基因（TIGIT、IL2RG、ICOS、SH2D1A、SLAMF6和GZMA）表达与患者生存显著相关（图9A）；
验证队列13个关键基因（TIGIT、SH2D1A、LCK、PD-L1、GZMA、CXCR6、ICOS、IL2RG、SLAMF8、STX11、CD247、RHOH和PDCD1LG2）表达与患者生存密切相关（图9B）。
图9 15个关键基因与卵巢癌预后的关系Figure 9 Survival curves of 15 hub genes grouped by themedian of each gene expression
TIME是肿瘤细胞所处周围环境的免疫格局，包含淋巴细胞、固有免疫细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞。大量研究证实，TIME与多种肿瘤疾病预后密切相关［27］，包括卵巢癌［7，28］、非小细胞肺癌［29］、三阴性乳腺癌［30］和结直肠癌［31］。本研究中，ssGSEA分析和ESTIMATE分析的结果证实了PD-L1表达对卵巢癌TIME的影响，高表达组具有更强的免疫应答能力，并提示患者良好的预后。
本研究旨在探讨miRNAs对卵巢癌TIME的影响，而辨别不同的肿瘤免疫格局非常重要。PD-L1是最重要的免疫相关基因之一，与T细胞免疫功能密切相关，大量研究将其作为判断肿瘤免疫状态的评价指标。然而，截至目前，PD-L1表达最佳阈值尚不清楚。本研究基于卵巢癌患者疗效和OS获得PD-L1表达最佳阈值，即第90百分位数。生存分析结果高度支持PD-L1表达最佳阈值的适用性和可靠性。
DEG筛选和WGCNA分析是甄别关键基因的重要方法。本研究结合两种分析方法，根据基因相关性、连接度、频次和权重筛选重要miRNA和关键基因。DEGs相关性分析和WGCNA结果均高度支持hsa-mir-7702在卵巢癌患者肿瘤免疫格局形成过程的重要性。15个hsa-mir-7702相关的关键基因主要包括ICOS、PDCD1LG2、TIGIT、SH2D1A、IL2RG、CXCR6、STX11、SLAMF6、P2RY10、RHOH、CD247、GZMA、SLAMF8、CYTIP和LCK。已经明 确，ICOS、PDCD1LG2、TIGIT 和SLAMF6是重要的免疫相关共信号分子［32］。PPI分析提示，15个关键基因存在直接或间接的相互作用。进一步的KEGG分析和GO分析结果提示15个关键基因主要涉及肿瘤免疫相关信号通路，并介导T细胞免疫应答的所有环节，包括致敏、激活、增殖、迁移、识别和杀伤。因此，推测hsamir-7702可能通过调控15个关键基因介导卵巢癌TIME形成。
许多研究证实了miRNA对卵巢癌TIME的调控作用，如miRNA424可通过抑制PD-L1和CD80表达，恢复T细胞免疫应答能力，扭转化疗药物耐药［21］；
miRNA145可在体外通过结合c-Myc转录因子下调卵巢癌细胞PD-L1的表达［20］；
miRNA92可通过抑制LATS2表达介导卵巢癌细胞PD-L1表达上调［19］。目前，尚未有hsa-mir-7702对卵巢癌TIME影响的相关报道。一项涉及结直肠癌的研究表明，hsa-mir-7702可通过靶向作用于转录衔接因子1（transcriptional adaptor 1，TADA1）而抑制肿瘤细胞迁移和侵袭［33］；
另一项关于恶性黑色素瘤研究发现，hsa-mir-7702表达与PD-L1呈正相关［34］。此外，hsa-mir-7702在多个生物信息学相关的肿瘤风险预测模型均有报道，包括结直肠癌［35］、黑色素瘤［36］、膀胱癌［37-38］和乳腺癌［39］。本研究ssGSEA分析结果提示，hsamir-7702表达上调有利于促进卵巢癌患者的肿瘤免疫应答能力，包括免疫功能和免疫细胞浸润。尽管验证队列样本量有限，但是也表现出同样趋势。此外，PD-L1和hsa-mir-7702均高表达的患者具有更强的免疫应答能力。基于以上结果，本研究认为hsa-mir-7702可能通过调控15个关键基因而对卵巢癌肿瘤免疫格局产生影响。
关键基因通过各种机制参与肿瘤疾病发生、发展并影响患者预后。本研究发现训练队列6个关键基因与卵巢癌患者生存密切相关，包括IL2RG、TIGIT、ICOS、SH2D1A、SLAMF6和GZMA；
验证队列13个关键基因与患者预后显著相关。表明15个关键基因对卵巢癌预后转归具有重要作用，但由于恶性肿瘤具有异质性，在不同群体中所主导作用可能存在一定差异。
本研究支持hsa-mir-7702对卵巢癌肿瘤微环境的免疫调节作用，但仍存在一定局限性，首先，本课题基于生物信息学方法进行数据分析，方法较为单一；
其次，部分验证队列样本量小，所得结论可能存在一定误差。因此，后续研究将针对hsa-mir-7702深入挖掘。
作者贡献声明
赵爱月：数据收集和整理，文献检索，撰写论文；
苏云霞：数据收集和整理；
傅德强：提出研究思路、统计分析数据，论文审阅和修改。
利益冲突声明
本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。
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