曹莹琪 江晓晗 曾 欢 刘晓婷 周向梅 袁建敏
(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193)(2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193)
软饮料的消费已成为一个高度可见和有争议的公共卫生和公共政策问题。数据显示我国成人居民来自含糖饮料的添加糖摄入量平均每人每日为13.4 g，且总体消费率呈上升趋势[1]。软饮料被许多人认为是肥胖症和相关健康问题的主要贡献者，而关于软饮料对机体生长发育、组织脏器等方面的研究较少。本研究选择市场上常见的四种软饮料——美年达、可乐、绿茶饮料、咖啡饮料，给小鼠饮用2个月，观察小鼠增重、血清生化指标、器官系数以及组织细胞损伤等，进行综合比较和分析，以期为人们科学合理地饮用软饮料提供参考。
1.1 实验动物
选用断乳SPF 级KM小鼠80只，雌雄各40只，雄鼠体质量12.2～15.0 g，雌鼠体质量7.8～9.5 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物的生产许可证号【SCXK(京)2016-0006】。动物实验在中国农业大学实验动物房进行，实验动物使用许可证号【SYXK(京)2020-0037】，所有实验均获得中国农业大学动物医学院实验动物伦理委员会的批准与监督【IACUC号：AW02010202-2】。实验者严格遵循国际实验动物福利伦理“3R”原则，给予小鼠应有的人道关怀。小鼠饲养于清洁级实验动物房，环境温度(24.72±1.90)℃，环境相对湿度64.40%±17.59%。
1.2 实验饲料
由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF级小鼠饲料以及垫料；
实验饮料为美年达、百事可乐、统一绿茶和三得利利趣拿铁，均为合格市售品牌，且均在保质期内；
对照组饮用煮沸后自然冷却的北京市自来水。
1.3 仪器设备
全自动生化仪(型号：日立7600，日立集团)，放免仪(型号：xh6080，西安核仪厂)，电子天平(型号：JM1102-JM1003，上海纪铭)，冷冻型高速台式离心机(型号：SORVALL Stratos，Thermo)。生化指标由北京莱雅生物科技有限公司分析检测完成。
2.1 实验分组
将80只小鼠随机分为5个处理组，分别是美年达组、可乐组、绿茶组、咖啡组和白开水组，每组8只雌鼠和8只雄鼠，雌雄分笼饲养。整个实验过程中, 每组小鼠均饲以相同饲料，自由进食, 并饮用相应的饮料。实验期间，每10 d测1次体质量和采食量。
2.2 样本采集和处理
实验第66天，每个处理组分别取5只雄鼠和5只雌鼠。采用摘眼球采血法取得血液样品，分离血清样本，检测生化指标。安乐死小鼠后分离双侧股骨、心脏、肝、脾、肺、肾，并用电子称精确称重，计算脏器系数。每组随机取3只雄鼠和3只雌鼠的肝、肾组织，制作病理切片。
2.3 血液生化指标的测定
由北京莱雅生物科技有限公司检测钙、血糖(blood glucose,GLU)、三酰甘油(triglyceride,TG)、尿素氮(UREA/blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,CRE)、白蛋白(albumin,ALB)、总蛋白(total protein,TP)水平，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天门冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)活力。
2.4 小鼠肝和肾病理切片
将肝与肾组织固定于4%多聚甲醛中，进行常规石蜡包埋、切片、HE染色并观察。
2.5 统计学分析
3.1 不同类型饮料对小鼠增重及日均采食量的影响
由图1可知，实验第10天，与白开水组相比雄鼠饮用美年达、可乐、绿茶和咖啡后的体质量均显著增加(P<0.05)；
实验第20天，雄鼠饮用美年达、可乐、绿茶后的体质量均显著高于咖啡组和白开水组(P<0.05)；
在实验第30～66天时，同时期的各饮料组的雄鼠体质量较对照组减少，但无统计学差异(P>0.05)。由图2可知，各时段不同饮料处理组的雄鼠日采食量少于白开水组。
图1 不同组别雄鼠的体质量变化
图2 不同组别雄鼠的日均采食量
由图3可知，实验第10天，雌鼠饮用美年达、绿茶、咖啡后的体质量均显著高于白开水组(P<0.05)；
实验第20、30天，与白开水组相比，雌鼠饮用4种软饮料后的体质量均显著增加(P<0.05)；
在实验第40、50、60天，同时期的处理组间无显著性差异(P>0.05)；
实验第66天，雌鼠饮用美年达、咖啡后，体质量显著高于白开水组(P<0.05)。在整个实验阶段，饮用各种饮料的雌鼠体质量均有所升高。由图4可知，咖啡组的雌鼠采食量在实验后期高于其他组，美年达组在各期均低于其他组。
图3 不同组别雌鼠的体质量变化
图4 不同组别雌鼠的日均采食量
3.2 不同类型饮料对小鼠脏器系数的影响
由表1，2可知，除脾系数(P<0.05)和肺系数(P<0.05)外，不同类型饮料对雌雄小鼠的心脏系数、肝系数、肺系数、肾系数和肱骨系数无显著影响(P>0.05)。
表1 不同组别雄鼠的内脏器官指数(%)
表2 不同组别雌鼠的内脏器官指数(%)
3.3 不同类型饮料对小鼠血液生化指标的影响
由表3可知，雄鼠饮用美年达、可乐后的尿素氮水平显著低于其余处理组(P<0.05)；
饮用绿茶的雄鼠三酰甘油含量显著高于白开水对照组(P<0.05)；
雄鼠饮用该4种不同的饮料后，其总蛋白含量均高于白开水对照组，但除绿茶组外其余处理组均无统计学意义(P>0.05)。血糖、肌酐、白蛋白等指标在各处理组间均无统计学差异(P>0.05)。
表3 不同组别雄鼠的生化指标
由表4可知，不同类型饮料对雌鼠的生化指标影响比对雄鼠的影响更为明显。雌鼠饮用该4种软饮料后，其尿素氮水平均显著低于白开水对照组(P<0.05)。雌鼠饮用美年达和绿茶后的肌酐水平显著低于白开水对照组(P<0.05)。4个处理组的碱性磷酸酶、谷草转氨酶的含量均低于白开水组，其三酰甘油含量均高于白开水组。
表4 不同组别雌鼠的生化指标
3.4 不同类型饮料对小鼠肝、肾组织结构的影响
美年达和可乐组的肝损伤程度最高，绿茶和咖啡组损伤程度较轻。由图5中可看出，白开水组小鼠肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，肝窦清晰，肝细胞形态大小正常，细胞质均匀，细胞核明显，且无变性坏死，肝细胞内未出现脂滴。而美年达和绿茶组的肝小叶结构不清晰，肝索排列紊乱，肝细胞肿胀，界限不清，胞质里有红染颗粒，即出现了一定程度的颗粒变性。可乐组肝细胞中可见细胞肿胀，胞质疏松，胞质淡染或呈大小不一的空泡，且出现了炎性细胞浸润。咖啡组肝细胞界限不清，胞质内有红染颗粒，颗粒变性较为严重。
注：A.细胞肿大，胞质出现空泡；
B.炎性细胞浸润；
C.细胞肿大，胞质出现空泡；
D.细胞内的红染颗粒，细胞界限不清；
E.肝正常。F、G、H出现蛋白管型，I、J为正常肾。
白开水组小鼠的肾组织结构正常，肾小管形态正常，各结构间界限清晰。美年达、可乐、绿茶组肾小管内可见蛋白管型，咖啡组肾组织正常。
以上结果说明软饮料可引起机体的物质代谢障碍，对组织细胞造成损伤。
在实验前期，饮用美年达、绿茶和可乐的雄鼠体质量均显著高于白开水组，实验后期则明显降低。而饮用咖啡的雄鼠体质量在整个实验过程中大多高于白开水组。相比于雄鼠，软饮料对雌鼠的增重影响更为明显，在整个实验过程中，饮用4种饮料的雌鼠体质量均高于白开水组。这是因为这4种饮料中均含有较高的糖分，增加了摄入的能量，虽然实验早期小鼠通过减少食物摄入来维持摄入总能量的平衡[2]，但总体上能量摄入仍过多，故体质量均明显增加[3-4]。但长期饮用含糖饮料会抑制小鼠食欲，导致其进食减少，营养不均衡[5]，因此雄鼠体质量在实验后期下降，但由于对雌鼠的食欲抑制较不明显，故雌鼠体质量并没有下降。相比于其他饮料，咖啡对雌雄鼠的食欲抑制较小，原因可能是咖啡因可兴奋中枢神经系统的迷走中枢，刺激迷走神经胃支，从而引起胃泌酸增加和胃腺分泌亢进[6]。
脏器系数的变化通常可以较好地反映受试物对实验动物脏器的影响或者初步的毒性判断。本次研究中，各处理组心脏、肝、肾、肱骨的脏器系数和白开水组无显著差异，与参考文献[7]的研究相符。由此看出，该4种饮料对小鼠的心脏、肝、肾和肱骨的发育无急性毒性损伤作用。
在血清生化指标方面，本实验中小鼠饮用软饮料后总蛋白含量显著升高。血清总蛋白主要反映肝在蛋白质代谢方面的功能、慢性肝损伤及其病情程度以及肝实质细胞的储备功能[8]。本实验中总蛋白升高的原因可能是软饮料中含有较多的糖类、色素等物质，使机体血液渗透压升高，进而导致脱水所致。尿素氮是动物蛋白质在肝代谢后的最终产物，血清尿素氮和肌酐含量可反映动物肝、肾的损伤程度。本实验中，小鼠饮用软饮料后的尿素氮、肌酐含量均降低，无临床诊断意义，说明软饮料对小鼠的损伤并不显著。大量果糖摄入可快速刺激脂肪生成和三酰甘油的积累[9]，本实验中雌鼠饮用4种饮料后，血清三酰甘油均增加，这可能会增加患冠心病的危险性，而且三酰甘油过高还会引起脂肪肝、糖尿病、慢性肾炎等疾病[8]。在血糖指标上，本实验与参考文献[7]的研究相符，饮用软饮料并未造成血糖含量的显著变化。
软饮料中含有高果糖玉米糖浆，果糖转化成的脂肪在肝中积累可导致非酒精性脂肪肝疾病。此外可乐中含有的焦糖色素富含高级糖基化终产物，也可能增加胰岛素抵抗和产生炎性反应。胰岛素抵抗和氧化应激增加了游离脂肪酸向肝的输送，肝三酰甘油酯积累的增加也导致了脂肪肝[10]。果糖过多导致大鼠肝组织脂质过氧化和脂肪变性，脂质过氧化可能在果糖诱导的肝细胞损伤中起作用[11]。这与本实验碳酸饮料组导致肝组织变性、炎性细胞浸润结果一致。有研究[12-13]发现长期饮用碳酸饮料会对肾的组织产生不利影响，出现明显的蛋白尿，肾小管中出现透明管型等，且饮用富含果糖的饮料后可观察到更大的肾氧化应激和轻度肾损伤(肾小球和肾小管改变)[14]，这与本研究中肾出现蛋白管型的结果一致。而未见咖啡和绿茶对肝损伤的相关报道，实验结果出现了轻度损伤的可能原因是咖啡和茶饮料当中含有较多的糖分。
值得关注的是，长期饮用上述4种软饮料对雌鼠的影响比对雄鼠的影响更为明显，推测其可能与性激素影响某些代谢酶的活性有关，有研究表明，雄性激素能够促进细胞色素P-450的活性，而雌性激素可以抑制肝微粒体的氧化过程，所以一些化学物对雌性动物的不良影响显著大于对雄性动物的不良影响[15]。
综上所述，本实验表明长期饮用软饮料对小鼠的生长发育存在不良影响，促进小鼠早期增重过快并促进脂肪的合成，同时也会使肝、肾组织出现一定程度的病理变化。
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