张自伟，汪鸿鹏，朱泓冰，冯筱霂，殷若可
(皖南医学院法医学院，安徽 芜湖 241002)
血液中乙醇浓度的测定是法医毒物分析的重要研究内容，在交通肇事，医疗纠纷，酒后死亡等案件中有着重要意义。国内外学者长期致力于发展血液中乙醇浓度测定方法，目前的方法主要有生物传感器法[1]、化学法[2]、气相色谱法[3-4]、气相色谱-质谱联用法[5]。此外，血液的采样方式、储存容器中有无抗凝剂等也会影响血液中乙醇浓度的测定，特别是血液的保存方式对乙醇浓度的结果有着至关重要的影响。针对这个问题，国内外学者就血液样品中乙醇稳定性问题开展了一系列研究[6-7]。然而，目前的乙醇稳定性模型主要探讨了多个影响因素的共同作用。然而，多因素之间可能存在的交互作用使得研究模型在实际运用中要做修正。本工作结合法医毒物司法鉴定工作需要，首先建立并优化血液中乙醇浓度测定方法。其次，考察离体血液样品在单因素即4 ℃冷藏保存条件下乙醇浓度的稳定性。更为重要的是，运用文中的方法对构建的离体血液中乙醇单因素稳定性模型进行精准分析，以期为血液中乙醇浓度测定法医司法鉴定项目提供理论参考和经验指导。
1.1 仪器与试剂气相色谱仪(Agilent 7890B)，配有火焰离子化检测器；
自动进样系统(Agilent 7697A)顶空进样器；
顶空瓶(20 mL)；
定量环(1 mL)；
精密移液器(20～200 μL，100～1 000 μL)；
封口钳；
硅橡胶垫、铝帽。ELGApurelab flex2超纯水仪(18.2 MΩ·cm，英国)。乙醇标准溶液(sigma公司，浓度分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL)；
叔丁醇标准溶液(天津市光复精细化工研究所，GCS 5 mL/支)；
混合醇标准溶液A-061(4 mg/mL，美国Cerrilliant公司)，组成为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇；
超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。
1.2 实验条件
1.2.1 Agilent 7890B气相色谱仪条件 色谱柱：HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；
DB-ALC2(30 m×0.32 mm×1.20 μm)；
柱温：40 ℃；
检测器：火焰离子化检测器(FID)；
检测器温度：300 ℃；
进样口温度：200 ℃；
载气流速：1.8 mL/min；
隔垫吹扫速度：3 mL/min。
1.2.2 Agilent 7697A顶空自动进样器条件 传输线温度：100 ℃；
样品瓶加热平衡时间：10 min。程序升温程序为：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至110 ℃。
1.3 研究方法
1.3.1 离体血液中乙醇单因素稳定性模型构建 模型构建时选择了两个已知浓度分别为1.31 mg/mL(sample1)和0.61 mg/mL(sample2)的离体血液样品和一个已知浓度为0.1 mg/mL(control sample)乙醇标准溶液作为质量控制样品。离体血液乙醇单因素稳定性研究模型的构建是在空白全血中加入一定量的乙醇标准溶液制得，且空白全血中无凝血并不含传染病菌及干扰乙醇测定的挥发性物质。乙醇标准溶液是5 g乙醇标样加超纯水稀释至50 mL制得。血液体积5 mL，密闭在抗凝管中，置于冰箱4 ℃冷藏。
1.3.2 内标工作溶液的配制 称取0.5 g叔丁醇标准溶液置于100 mL容量瓶中，超纯水稀释至刻度，所得母液浓度为5 mg/mL。移取0.8 mL母液置于100 mL容量瓶中，超纯水稀释至刻度，所得内标工作溶液浓度为0.04 mg/mL。
1.3.3 实验操作 取已知浓度的乙醇样品100 μL及叔丁醇内标工作溶液(0.04 mg/mL)500 μL加入顶空瓶内，封口钳将其迅速密封，混匀后置于顶空进样器内加热待检。已知浓度质量控制样品(0.1 mg/mL)的处理方式同乙醇样品。
1.3.4 HS-GC-IS方法的验证 对检出限、线性范围、日内精密度、日间精密度进行验证。以信噪比S/N≥3时的浓度作为检出限，回归分析采用线性模型，用最小二乘法进行拟合。日内精密度的计算方法为同一份样品一天内平行测定7次，计算相对标准偏差(RSD)；
日间精密度的计算方法为同一份样品连续测定三天，计算相对标准偏差(RSD)。
1.3.5 稳定性研究 实验中对1.3.1稳定模型进行研究，每隔一个月测定样品sample1和sample2的BEC-IV，连续测定七个月。测试过程中实验环境保持在25 ℃，相对湿度保持在小于等于80%。每次离体血液样品取样结束后立即塞上密封塞并用封口膜封口，置于4 ℃冰箱中冷藏保存。
1.4 统计学方法用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析，由“均数±标准差”表示处理后的数据，并对数据进行单因素方差分析，P<0.05则差异具有统计学意义。
2.1 HS-GC-IS方法的建立和优化实验中优化了进样量、升温程序、色谱柱等一系列色谱条件，从而确定了1.2.1部分的实验条件。优化条件时重点探讨了不同型号色谱柱对血液中乙醇定性分析的影响。结果发现DB-ALC2柱和HP-5柱相比，同样的柱长和内径，DB-ALC2柱的分离能力更强，色谱峰更对称(见图1和图2)。在该柱上乙醇的出峰时间(3.697 min)和叔丁醇内标的出峰时间(4.704 min)时间间隔为1.007 min，然而，在HP-5柱上乙醇的出峰时间(1.918 min)和叔丁醇内标的出峰时间(2.045 min)时间间隔仅为0.127 min。
图1 血液样品在不同型号色谱柱下的流出图
图2 混合醇标准品在不同型号色谱柱下的流出图
因此，实验最终选择了DB-ALC2色谱柱。有文献报道血液在腐败过程中会产生甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇等[7]，为避免血液腐败生成物对测定的干扰，最终选择叔丁醇作为血液中乙醇浓度测定的内标物。本研究的实验结果也表明4 ℃保存条件下离体血液样品在保存期间的第二月即开始产生新的物质(见图3)，有研究表明血液样品在存放半个月或者更长的时间后会产生正丙醇，但是由于样品的差异性还可能产生其他成分[7]。
图3 HS-GC-IS下血液样品和乙醇标准品色谱流出图
2.2 HS-GC-IS方法的验证结果从检出限、线性范围、日内精密度、日间精密度等方面对HS-GC-IS进行了验证。检出限为5 ng/mL，线性范围为0.01～3 mg/mL，回归分析采用线性模型，线性方程为Y=1.139 8X+0.004 9(r=0.999 9，其中Y是乙醇峰面积和叔丁醇峰面积的比值，X是乙醇标准溶液的浓度；
r是相关系数)。日内和日间精密度结果见表1，日内精密度的范围是1.43%～4.21%，日间精密度为3.48%。
表1 日内精密度和日间精密度
2.3 稳定性研究结果及意义分析BEC-IV稳定性结果见图4。图4显示BEC-IV为1.31 mg/mL的sample1(红线)在4 ℃冷藏条件下首先快速下降，随后缓慢上升到接近初始值后再快速下降。4 ℃冷藏放置一定时间后血液中乙醇浓度上升的原因是血液腐败过程中也会产生乙醇，这提示我们对于腐败血液样品不仅要测定乙醇浓度还应同时测定生成物如正丙醇的浓度以期得出乙醇的精准浓度，从而保证分析结果的准确性。BEC-IV为0.61 mg/mL的sample2(蓝线)变化趋势和sample1基本保持一致。已知浓度为0.1 mg/mL的control sample(绿线)乙醇浓度变化在测试的7个月内基本保持稳定。在给定显著性水平P=0.05的前提下，通过方差齐协性检验评价sample1、sample2和control sample检测结果有无显著性差异。Sample1的浓度为(1.267±0.058)mg/mL，sample2的浓度为(0.554±0.021)mg/mL，control sample的浓度为(0.094±0.005)mg/mL。同时，进一步通过方差分析评价sample组和control组的检测结果有无显著性差异。统计结果显示F=2 594.400，P(sig)=0.000<0.05，说明不同组间的血液中乙醇浓度具有统计学意义。此外，进一步进行两两多重性比较，结果显示不同组间分析具有统计学意义。BEC-IV的稳定性结果显示在一个月内sample1乙醇浓度减少的相对值为9.8%，sample2乙醇浓度减少的相对值为1.7%。同时，我们进一步考察了血液样品生成物(见图3)在研究时间范围内浓度变化趋势。实验中观察到无论稳定性模型的样品起始浓度是1.31 mg/mL还是0.61 mg/mL，生成物的绝对浓度随着时间都呈上升趋势；
并且，血液中乙醇起始浓度对其绝对浓度影响不大(见图5)，因此我们推测该物质并不是由乙醇变化产生的，极有可能是血液的腐败产生的。
图4 BEC-IV随时间变化的结果
图5 离体血液中生成物浓度随时间变化的结果
乙醇(ethanol)，分子量46，沸点78.4 ℃，属挥发性毒物。顶空进样法别适用于分析检测挥发性毒物。这是因为该方法只将挥发性组分引入分离系统，排除了生物样品基质的干扰，避免了冗长繁杂的样品前处理过程。此外，乙醇分子量小、沸点低，适用于气相色谱法(Gas chromatography,GC)。综上，顶空-气相色谱法(Headspace-Gas chromatography,HS-GC)能够应用到血液中乙醇浓度的测定，且具有样品前处理简单和分析时间快的优点。定量乙醇的方法有外标法和内标法。内标(internal standard,IS)法和外标法相比，由于该法定量时标准样品和待测样品中同等加入了内标物，排除了系统误差，所测定的结果更加准确。实验中通过一系列色谱条件优化和方法学验证，建立了一种BEC-IV测定方法即HS-GC-IS法，并用于BEC-IV单因素4 ℃下的稳定型研究。学者Kosecki P.A等研究结果表明乙醇浓度的变化和起始浓度无关[8]，因而模型构建时选择了已知浓度分别为1.31 mg/mL(sample1)和0.61 mg/mL(sample2)的离体血液样品。结果表明建立的HS-GC-IS法准确性高、灵敏度高、线性范围宽。BEC-IV稳定性结果表明对于血液样品尤其是乙醇浓度高的血液样品在第一月内乙醇浓度降低速率最快；
且随着血液样品保存时间的延长，浓度由于血液的腐败会产生新的物质浓度。然而，本论文并没有对新产生物质的结构进行确证，后期我们将运用质谱手段对该物质进行定性和定量分析，以期确定它是何种物质并进一步探究它和血液样品中乙醇浓度的相关性。
综上所述，本文发展了一种BEC-IV测定方法即HS-GC-IS法，并运用它对构建的BEC-IV单因素稳定型研究模型进行分析。结果表明对于血液样品尤其是乙醇高的血液样品应尽早检测，若不能及时检测应冷冻保存以确保样品复查结果的有效性。此外，本工作也提示法医毒物司法鉴定人员在分析BEC-IV时还应考虑血液腐败的问题，以期得到准确客观的数据为法医毒物司法鉴定项目提供理论参考和经验指导。
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