杨琪，董佳萍，谢琳琳，王鹤霖，刘殊凡，迟晓星，2，3
（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；
2.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心；
3.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心）
多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的内分泌和代谢紊乱疾病[1]，会导致育龄女性不孕不育，全球发病率为4%～21%[2]。患有PCOS 病的妇女表现出高雄激素血症、高胰岛素血症、无排卵和多囊卵巢形态[3]。先前的研究表明，PCOS 与多种代谢异常有关，包括体脂增加、血脂异常、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良和高血压[4]。PCOS 及其引起的多种异常也会增加相关疾病的风险，如卵巢癌症、糖尿病和心血管疾病等[5]。另一方面，胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）是PCOS 病理生理学的基础[6]，大多数PCOS 患者的肥胖和胰岛素抵抗指数风险较高[7]。有学者认为，胰岛素抵抗很可能是PCOS 患者发生糖脂代谢异常的主要原因[8]。PCOS 的胰岛素抵抗和血脂异常与脂肪因子密切相关[9]，如脂联素（Adiponectin，APN）、内脂素等，还有其它一些蛋白质已经作为评价PCOS 胰岛素抵抗的新标记物，如抵抗素、瘦素、血清视黄醇结合蛋白-4（retinol-binding protein 4，RBP4），但是它们的作用仍然存在争议，其中脂联素和RBP4 的功能紊乱被认为是影响PCOS 女性代谢紊乱的最主要因素[10]。目前PCOS 的病因和发病机制尚不清楚；
IR 是PCOS 病理生理过程中的中心环节，改善PCOS 患者的IR，对降低PCOS 患者的高血脂，进而改善患者的临床症状，恢复患者的排卵功能具有重要意义。
越来越多的研究致力于使用天然活性成分减轻PCOS 的症状。金雀异黄素（Genistein，Gen）、大豆苷元和黄豆黄素是最近研究的最突出的异黄酮[11]。Gen是一种植物雌激素，与雌激素具有结构相似性。进入人体后，Gen 可完全与雌激素受体结合，发挥雌激素的作用，被认为是雌激素的天然替代品[12]。据报道，异黄酮可以增加糖尿病大鼠的血清胰岛素，防止氧化应激[13]。研究发现发现补充植物雌激素可显著降低大鼠的总胆固醇水平和低密度脂蛋白[14]。Gen 的有益效果可能与改善胰岛素敏感性和改善血脂谱有关[15]。但是并未见Gen 对多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗和血脂的相关研究。因此，通过皮下注射脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）结合高脂饲料建立多囊卵巢综合征并发胰岛素抵抗（PCOSIR）大鼠模型，使用该模型研究Gen 对多囊卵巢综合征大鼠体重、脏器重、血糖、胰岛素抵抗指数及血脂等指标的影响，考察Gen 对多囊卵巢综合征大鼠血脂及胰岛素抵抗的改善作用，旨在为PCOS 患者的临床治疗提供新的靶点，也为未来开发Gen 保健食品提供一些基础理论依据。
1.1 实验动物
实验动物为健康22 日龄雌性SD（Sprague Dawley）大鼠，SPF 级，60 只，体重180～220 g，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司。许可证号：SCXK（辽）2020-0001。购买后置于鼠房自由饮水、饮食，适应1 周后开始试验。实验遵循黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会原则。
1.2 实验试剂
金雀异黄素（纯度99.99%）购于上海融合有限公司；
去氢表雄酮、二甲双胍购自中国麦克林公司；
人绒毛膜促性腺激素购于深圳海思安生物技术有限公司；
注射用大豆油购于浙江山雨田有限公司；
血清胰岛素（Fins）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）试剂盒购于南京建成生物技术有限公司；
脂联素（Adiponectin，APN）、血清视黄醇结合蛋白-4（retinolbinding protein 4，RBP4）、瘦素（Leptin）、脂联素受体1（Adiponectin Receptor 1，AR1）、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1，IRS1）、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporters4，GLUT4）试剂盒购于上海严谨生物技术有限公司。
1.3 实验设备
GA3 型血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）；
酶标仪（中国Mindrary 迈瑞医疗公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法
参考胡伟[17]确立的PCOS-IR 模型大鼠构建方法：60 只22 日龄雌性Sprague Dawley（SD）大鼠按体重随机分为对照组（10 只）和PCOS-IR 造模组（50只），模型组大鼠每日皮下注射脱氢表雄酮6 mg/100 g bw+0.2 mL 注射用大豆油，腹部皮下注射1.5 U 人绒毛膜促性腺激素（HCG），每日一次，共42 d。同时，模型组的大鼠喂饲高脂饲料，诱导PCOS-IR 模型。对照组大鼠皮下注射相同体积的注射用油、生理盐水和正常饮食。
1.4.2 分组及给药方式
60 只SD 大鼠按体重随机分为对照组（10 只）和PCOS-IR 造模组（50 只），造模成功的大鼠分成模型组、Gen 低、中、高剂量组、二甲双胍组，每组10 只。造模成功后，对照组和模型组不加Gen 治疗，给予等体积花生油；
各Gen 剂量组分别给予Gen（溶于花生油）10、20、30 mg·（kg·d）-1，阳性对照组给予二甲双胍200 mg·（kg·d）-1，每日一次，连续21 d，期间记录大鼠体重。
1.4.3 取样
末次给药，禁食12 h，乙醚麻醉，血糖仪测定空腹血糖值，于腹主动脉取血，置于离心管中，室温静置，3 000 r·min-1离心15 min，吸取上层血清，冻存于-80 ℃冰箱；
摘除子宫、卵巢组织，称取子宫、卵巢组织的重量；
取腹膜后白色脂肪组织，冻存于-80 ℃冰箱。
1.4.4 血清样本的检测
取出-80 ℃保存的血清，4 ℃冰箱缓存，放置于冰上溶解。ELISA 法检测血清中胰岛素、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的表达水平。
1.4.5 脂肪组织样本的检测
取出-80 ℃保存的脂肪组织，置于冰上，把组织剪切成细小的碎片。按照每20 mg 组织加入150～250 μL 中性蛋白裂解液的比例加入裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。将裂解后样品10 000～14 000 g 离心3～5 min，取上清液，ELISA 检测脂肪中瘦素、脂联素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表达水平。
1.5 统计分析
实验数据用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，采用ANOVA 法进行组间比较，各组数据用平均数±标准差（X±S）表示，模型组与对照组间具有显著性差异的用“#（P＜0.05）”或“##（P＜0.01）”进行标注，模型组与Gen 剂量组和阳性对照组样本均数间具有显著性差异的用“*（P＜0.05）”或“**（P＜0.01）”进行标注，P＜0.05 认为差异有显著性。
2.1 Gen 对各组大鼠体重、子宫和卵巢重量的影响
2.1.1 Gen 对各组大鼠体重的影响
图1 灌胃期间各组大鼠体重Fig.1 Body weight of rats in each group during gavage
灌胃期间各组大鼠体重变化如图所示，第7 天各组大鼠体重与第0 天相比变化都为上升趋势，其中对照组和模型组体重增长20～25 g，其他剂量组和二甲双胍组增加量较小；
到第14 天，对照组和模型组仍然处于上升趋势，但各剂量组和二甲双胍组有下降趋势，其中Gen-低剂量组下降25 g；
经过21 d灌胃后，模型组体重显著高于对照组62.17 g，与模型组相比，各剂量组体重显著降低，其中Gen-低、中剂量组分别降低14.72%和12.51%。实验结果表明，Gen可有效减轻PCOS 大鼠体重。
2.1.2 Gen 对各组大鼠子宫和卵巢质量的影响
各组大鼠卵巢和子宫质量如表1 所示，与对照组相比，模型组大鼠卵巢、子宫质量显著增大（P＜0.01），其中卵巢质量显著增加27.27%，子宫质量增加21.43%；
经过Gen 灌胃21 d 后，与模型组相比，Gen-各剂量组和二甲双胍组显著降低（P＜0.01），Gen-高剂量组在两者中都显著降低，卵巢质量显著降低21.43%，子宫质量显著降低17.65%。结果显示，Gen 可以改善PCOS 大鼠卵巢和子宫质量。
表1 各组大鼠卵巢、子宫质量Table 1 Quality of ovary and uterus of rats in each group
2.2 Gen 对各组大鼠空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗的影响
2.2.1 Gen 对各组大鼠第0 天和第21 天空腹血糖的影响
各组大鼠第0 天和第21 天空腹血糖值如图2所示，第0 天时，模型组空腹血糖值显著高于对照组（P＜0.01）；
经Gen 灌胃21 后，与对照组相比，模型组空腹血糖值显著升高（P＜0.01）；
与模型组相比，Gen各剂量组血糖显著下降，其中Gen-中剂量组与模型组相比显著降低13.95%（P＜0.01），与第0 天Gen-中剂量组相比降低10.15%。结果表明，Gen 可以有效降低PCOS 大鼠空腹血糖值，中剂量组效果与阳性对照药物二甲双胍效果几乎一致。
图2 各组大鼠空腹血糖值Fig.2 Fasting blood glucose of rats in each group
2.2.2 Gen 对各组大鼠第0 天和第21 天胰岛素含量的影响
各组大鼠第0 天和第21 天空腹胰岛素值如图3所示，第0 天时，模型组空腹胰岛素值显著高于对照组（P＜0.01）；
经Gen 灌胃21 d 后，与对照组相比，模型组空腹胰岛素值显著升高（P＜0.01）；
与模型组相比，Gen 各剂量组空腹胰岛素值显著下降（P＜0.01），其中Gen-高剂量组与模型组相比显著降低65.25%，与第0 天Gen-高剂量组相比降低64.08%。结果表明，Gen可以有效降低PCOS 大鼠空腹胰岛素值，高剂量组效果与阳性对照药物二甲双胍效果几乎一致。
图3 各组大鼠空腹胰岛素值Fig.3 Fasting insulin value of rats in each group
2.2.3 Gen 对各组大鼠第0 天和第21 天胰岛素抵抗指数的影响
各组大鼠第0 天和第21 天空腹胰岛素值如图4所示。第0 天时，模型组空腹胰岛素抵抗指数显著高于对照组（P＜0.01）；
经Gen 灌胃21 d 后，与对照组相比，模型组胰岛素抵抗指数显著升高（P＜0.01）；
与模型组相比，Gen 各剂量组胰岛素抵抗指数都有所下降，其中Gen-高剂量组与模型组相比显著降低63.10%，与第0 天Gen-高剂量组相比降低59.96%。结果表明，Gen 可以有效降低PCOS 大鼠胰岛素抵抗指数，高剂量组效果与阳性对照药物二甲双胍效果持平。
图4 各组大鼠胰岛素抵抗指数值Fig.4 Insulin resistance index of rats in each group
2.3 Gen 对各组大鼠血脂指标的影响
各组大鼠血脂指标如表2 所示，与对照组相比，模型组TG、TC、LDL-C 水平显著增加（P＜0.01），HDL-C 水平显著降低（P＜0.01）；
与模型组相比，Gen-各剂量组TG、TC、LDL-C 水平显著降低（P＜0.01），其中Gen-高剂量组与模型组比较TG 水平显著降低58.76%，TC 水平显著降低38.94%，LDL-C 水平显著降低35%；
；
与模型组相比，Gen-各剂量组HDL-C 水平显著提升（P＜0.01），其中Gen-高剂量组与模型组比较HDL-C 水平显著增高97.22%。结果表明，Gen可以有限降低PCOS 大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平，提高PCOS 大鼠血清HDL-C 水平。
表2 各组大鼠血脂指标Table 2 Blood lipid indexes of rats in each group
表3 各组大鼠脂肪细胞中瘦素、脂联素、RBP4、GLUT4、IRS-1 水平Table 3 Levels of leptin，adiponectin，RBP4，GLUT4 and IRS-1 in adipocytes of rats in each group
2.4 Gen 对各组大鼠脂肪细胞中瘦素、脂联素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表达的影响
各组大鼠脂肪细胞中的影响瘦素、脂联素、RBP4、GLUT4、IRS-1 表达水平如表2 所示，与对照组相比，模型组瘦素、RBP4 水平显著增加（P＜0.01），经Gen 灌胃21 d 后，与模型组比较，Gen-各剂量组瘦素、RBP4 水平显著降低，其中Gen-中剂量组瘦素水平比模型组下降30.77%（P＜0.01），Gen-高剂量组RBP4 水平比模型组下降36.18%（P＜0.01）；
模型组脂联素、GLUT4 和IRS-1 水平显著低于对照组大鼠脂肪组织中此指标的表达水平（P＜0.01），与模型组比较，经过Gen 灌胃21 d 后，Gen-高剂量组脂联素水平上升47.28%（P＜0.05），GLUT 水平增加73.71%（P＜0.01），IRS-1 水平提升43.74%（P＜0.01）。
胰岛素抵抗是指细胞、组织和器官等对胰岛素的敏感性下降，对葡萄糖的吸收代谢能力降低，代偿性的刺激胰岛β 细胞分泌更多的胰岛素以维持体内葡萄糖水平[16]，在PCOS 患者体内就会表现为高胰岛素血症[17]，从而导致机体空腹血糖受损甚至发生糖尿病等糖代谢异常疾病。刘舒婷等[18]研究发现，PCOS 患者血脂异常发生率与其IR 程度成正比。有文献报道大豆异黄酮（包括GEN 和大豆黄素）可改善高糖血症与高胰岛素血症[19-20]。Jayagopal 等[21]给32 例Ⅱ型糖尿病绝经后妇女饮食中添加植物雌激素（异黄酮132 mg·d-1）与安慰剂（纤维素30 g·d-1）12 周，发现植物雌激素可显著降低空腹血糖和空腹胰岛素水平，改善IR。Goo dman-G ruens 对绝经后女性的一项研究也表明GEN 和大豆黄素可以降低胰岛素对口服葡萄糖负荷的反应，改善胰岛素敏感性[22]。实验结果发现GEN 可以有效降低PCOS 大鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平，改善IR。这些结果说明GEN 能够有效改善PCOS 大鼠的糖代谢。
研究发现，脂联素素可以增强胰岛素敏感性促进联胰岛素分泌，同时抑制糖异生，但是PCOS 患者脂联素水平降低，导致糖异生增加[23]；
瘦素能够作用于胰岛素细胞受体，影响胰岛素分泌和释放，脂肪细胞分泌瘦素，进而导致IR，而且PCOS 患者都存在瘦素抵抗现象，进一步导致糖脂代谢异常[24-25]；
其次，过量的脂肪会导致胰岛素受体数量减少，胰岛素敏感性降低，进一步造成IR[26]。文章的实验结果也验证了上述内容，与对照组相比，模型组瘦素、RBP4水平显著增加，经Gen 灌胃后，瘦素、RBP4 水平显著降低；
模型组脂联素、GLUT4 和IRS-1 水平显著低于对照组，Gen 灌胃有效提高脂联素、GLUT4 和IRS-1 水平。
研究金雀异黄素对由皮下注射脱氢表雄酮（DHEA）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）结合高脂饲料建立的多囊卵巢综合征（PCOS-IR）大鼠血糖、血脂及胰岛素抵抗的改善作用。研究结果表明，J 金雀异黄素可以有效改善PCOS 大鼠体重、卵巢和子宫质量；
金雀异黄素通过调节瘦素、脂联素、RBP4、GLUT4和IRS-1 水平进一步改善PCOS 大鼠IR 现象，从而调节PCOS 大鼠血糖和血脂代谢情况。