周思佳，韩佃刚，董 俊，杨云庆，叶玲玲，李 静，张 冲，信吉阁
(1.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201；
2.昆明海关技术中心，云南 昆明 650228)
牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一种世界性重要传染病[1-2]。临床表现包括高烧、严重腹泻、黏膜糜烂和坏死，甚至在发病后数日内死亡；
孕牛感染则会出现流产、早产、胎儿畸形和持续性感染等[3]。BVDV 属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，仅有1 个血清型；
依据其5′非翻译区(5′-untranslated region，5′-UTR)及基因组结构差异已鉴定出3 个基因型，依次为BVDV-1、BVDV-2 和HoBi-like，BVDV-1 又 进一步区分出22 个基因亚型，BVDV-2 有4 个基因亚型[1,4-6]。近年来对中国各地区开展的多项BVDV 流行病学调查研究显示：中国主要流行的BVDV 亚型是BVDV-1a、BVDV-1c 和BVDV-1m[7-9]。2014 年GONG 等[10]对中国青海牦牛BVDV基因分型进行研究，分离鉴定其基因型为BVDV-1b、BVDV-1d 和BVDV-1q。可见，中国BVDV 流行毒株主要为1 型。
BVDV 的实验室检测方法主要有血清学检测和分子生物学检测[1]。实时荧光定量PCR 检测方法是针对病原的检测，不受动物机体本身免疫力的影响，是病毒检测最常用的方法之一。中国已经有BVDV 实时荧光定量RT-PCR 检测的国家标准和相关研究[11-12]，但病毒基因的不断加速变异导致传统的核酸检测方法会出现错检和漏检，故需要对病原基因进行全面分析并及时更新检测方法。中国牛病毒性腹泻流行毒株主要为1 型，目前特异性检测BVDV-1 型的方法较少，且没有特异性针对BVDV-1 型的实时荧光定量RT-PCR 检测标准，不足以支持对BVDV-1 的研究和流行情况的了解。
本研究通过对近5 年流行的BVDV-1 全基因序列进行比对分析，设计针对BVDV-1 的特异性引物和探针，经反应条件、体系优化和检测效果测试，建立BVDV-1 实时荧光定量RT-PCR 检测方法，并对云南省部分地区临床样本进行检测，以期为BVDV-1 的调查研究提供有效途径。
1.1 病毒和临床样品
供试BVDV 病毒、蓝舌病病毒(bluetongue virus，BTV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)和口蹄疫病毒(foot-andmouth disease virus，FMDV) O 型疫苗均由昆明海关技术中心动物检疫实验室保存，通过病毒DNA/RNA 提取试剂盒提取核酸；
172 份牛全血样品来源于云南省怒江、德宏和临沧等地。
1.2 主要试剂
病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自天隆科技(西安)有限公司；
凝胶回收试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司；
pMD19-T Vector Cloning Kit 载体购自中美泰和生物技术有限公司；
Trans5α Chemically Competent Cell 购自北京全式金生物技术股份有限公司；
HiScript Ⅱ U+One Step qRT-PCR Probe Kit (诺唯赞，货号Q223-01)购自诺唯赞生物科技(南京)有限公司；
50×TAE 缓冲液、琼脂糖、6×Loading buffer 和Marker Ⅰ均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 引物和探针的设计合成
从NCBI GenBank 下载BVDV-1 全基因序列，使用MegAlign 软件对其进行比对，分析基因序列保守区域；
根据实时荧光定量RT-PCR 引物与荧光探针设计原则，采用Premier 6.0 设计特异性上游引物2 条、下游引物1 条和荧光探针1 条(表1)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物和探针信息Tab.1 Information of primer and probe
1.4 引物筛选
使用HiScript Ⅱ U+One Step qRT-PCR Probe Kit 对设计的2 对引物进行筛选，并选择1 对最佳引物进行后续试验。反应体系为20.0 μL，包括2×One Step U+Mix 10.0 μL、One Step U+Enzyme Mix 1.0 μL、50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL、10 μmol/L 上游引物0.4 μL、10 μmol/L 下游引物0.4 μL、10 μmol/LTaqMan 探针0.2 μL、模板RNA 2.0 μL 和H2O 5.6 μL。反应程序为：55 ℃反转录15 min；
94 ℃预变性10 s；
92 ℃变性15 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，预扩增5 个循环；
92 ℃变性10 s，56 ℃退火、延伸1 min，采集FAM 荧光，扩增40 个循环。
1.5 反应条件优化
为达到最佳检测效果，使用方阵法对引物和探针浓度进行筛选。由于探针加入量较小，为保证试验的精确度，稀释引物浓度为10 μmol/L、探针浓度为1 μmol/L。反应总体系为20.0 μL，取上、下游引物终浓度分别为0.20、0.40、0.60 和0.80 μmol/L，探针浓度分别为0.10、0.15、0.20和0.25 μmol/L，反应体系和程序同1.4 节。
1.6 模板质粒的制备
经引物筛选后，使用选定的引物进行目的片段扩增，反应总体系为25.00 μL，包括2×One Step Mix (Dye plus) 12.50 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、10 μmol/L 上游引物1.00 μL、10 μmol/L下游引物1.00 μL、模 板RNA 2.00 μL 和H2O 7.25 μL。反应程序为：50 ℃ 反转录30 min；
94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增35 个循环；
72 ℃总延伸5 min。扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结束后若见条带与目的条带大小相符，便将琼脂糖凝胶中的条带切下放入1.5 mL 离心管中称量(凝胶质量100 mg，可视为100 μL)，参照凝胶回收试剂盒说明书进行后续产物回收。
按照pMD19-T Vector Cloning Kit 试剂盒说明书，将上一步回收的目的片段与pMD19-T 载体进行连接，构建重组质粒。将连接产物转化入Trans5α 感受态细胞中涂板培养。挑取单菌落于37 ℃、250 r/min 培养3～4 h，进行菌液PCR 鉴定。PCR 反应总体系25.0 μL，包括ExTaq12.5 μL、10 μmol/L 上游引物1.0 μL、10 μmol/L 下游引物1.0 μL、模板DNA 2.0 μL 和H2O 8.5 μL。反应程序为：95 ℃预变性7 min；
95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，扩增35 个循环；
72 ℃总延伸10 min。鉴定为阳性的质粒送至上海生工有限公司进行测序，并对阳性质粒进行扩繁及保存；
使用质粒提取试剂盒提取阳性质粒，测定并计算其浓度，用于后续试验。
1.7 灵敏度试验
经测定，1.5 节构建的BVDV 阳性模板质粒质量浓度为270 ng/μL，根据阿弗加德罗常数，将质粒质量浓度转换为相应的拷贝数，其转换公式为拷贝数=(质量/分子量)×6.0×1023。经计算，其分子量为955 020，拷贝数为1.70×1011。将模板质粒按照101～1011进行10 倍梯度稀释后，对11 个不同稀释度的模板质粒进行实时荧光定量PCR 检测，反应体系为1.5 节中优化的最佳反应体系，DNA 模板质粒为1.0 μL，测定试验的灵敏度。
1.8 特异性试验
按照病毒RNA/DNA 提取试剂盒说明书提取BVDV、CSFV、BTV、FMDV、VSV 和PPRV 等病毒样本的核酸，并进行实时荧光定量PCR 检测，以ddH2O 作为阴性对照进行特异性试验。
1.9 重复性试验
随机选取3 个不同稀释梯度(1.70×104、1.70×107和1.70×108)的BVDV 模板质粒，每个梯度样本重复3 次实时荧光定量PCR 检测，对结果进行数据统计分析，计算其变异系数并评价方法的重复性。
1.10 临床样本检测
采用本试验建立的BVDV-1 实时荧光定量RT-PCR 方法，对172 份临床样品(血样)进行检测。样品采自2021 年云南怒江、德宏和临沧等地具有腹泻临床症状的犊牛。
为检验本研究建立BVDV-1 检测方法的准确性，同时采用《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)[11]中的实时荧光定量RT-PCR 检测方法对临床样本进行检测，并对检测结果进行比较分析，引物和探针信息见表2。反应程序为：42 ℃反转录30 min；
94 ℃预变性3 min；
92 ℃变性15 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，预扩增5 个循环；
92 ℃变性10 s，56 ℃退火、延伸1 min，采集FAM 荧光，扩增40 个循环。
表2 国家标准中实时荧光定量RT-PCR 检测BVDV 的引物和探针Tab.2 Primers and probe for real-time fluorescence quantitative RT-PCR detection of BVDV in the national standard
2.1 引物筛选结果
由图1 和表3 可知：引物FW1+RV1 和FW2+RV1 的荧光值均较高，但FW1+RV1 的Ct 值最小，故选其作为最佳引物进行后续试验。
图1 引物筛选结果Fig.1 Primer screening results
表3 引物筛选的Ct 值Tab.3 Ct value of primer screening
2.2 反应条件优化
由图2 和表4 可知：探针浓度为 0.25 μmol/L、引物浓度为0.60 μmol/L 时荧光值较高，平均Ct值最小，故选择该引物和探针浓度进行后续试验。
图2 引物和探针筛选试验Fig.2 Primer and probe concentrations screening
表4 引物和探针筛选的Ct 值Tab.4 Ct value of primer and probe screening
2.3 模板质粒构建结果
对2.1 节筛选的引物进行目的片段扩增，经普通PCR 及凝胶电泳鉴定后，扩增片段与目的片段大小相符，均为171 bp (图3)。经测序后与参考序列比对结果显示：实验室保存的毒株基因序列与所下载参考序列同源性高，测序验证正确，获得阳性重组质粒。
图3 菌液PCR 凝胶电泳图Fig.3 Gel electrophoresis of bacterial PCR
2.4 灵敏度试验结果及标准曲线
经检测，BVDV 阳性质粒拷贝数为1.70 copies/μL 时仍可检出BVDV 阳性(图4 和表5)。所得标准曲线回归方程为：y=-3.259 9x+40.392 0，相关系数R2=0.998 4，线性关系良好。
图4 实时荧光定量RT-PCR 灵敏度检测扩增曲线Fig.4 Amplification curve of real-time fluorescence quantitative RT-PCR in sensitivity assay
表5 实时荧光定量RT-PCR 灵敏度试验对应Ct 值Tab.5 Ct value in the sensitivity assay of real-time fluorescence quantitative RT-PCR
2.5 特异性试验结果
由图5 和表6 可知：仅BVDV 可以被检测，其余病毒核酸均无扩增曲线且无Ct 值，表明所建立的BVDV-1 实时荧光定量RT-PCR 检测方法特异性良好。
图5 实时荧光定量RT-PCR 特异性试验结果Fig.5 Specificity assay results of real-time fluorescence quantitative RT-PCR
表6 实时荧光定量RT-PCR 特异性试验对应Ct 值Tab.6 Ct value of the specificity assay of real-time fluorescence quantitative RT-PCR
2.6 重复性试验结果
选取3 个不同稀释梯度(104、107和108)的BVDV 模板质粒进行重复性试验。由图6 和表7可知：同一稀释梯度的荧光曲线重复性较好，变异系数均小于1%，表明所建立的实时荧光定量 RTPCR 具有较好的重复性。
图6 3 个稀释梯度的重复性试验结果Fig.6 Repetitive assay results for three dilution gradients
表7 3 个稀释梯度的重复性试验Ct 值Tab.7 Ct value for three dilution gradients in repeatability assay
2.7 临床样本检测结果
由表8 可知：172 份临床样品(血样)中，有33 份检测为阳性，阳性率为19.19%。33 份样本经实时荧光定量RT-PCR 检测国家标准验证均为阳性，与本试验所建立的实时荧光定量RTPCR 检测结果完全一致。
表8 实时荧光定量RT-PCR 临床样本检测结果Tab.8 Clinical sample detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR
BVDV 已在世界各地广泛流行和蔓延，对中国牛养殖业也造成了重大的经济损失[1]。现阶段，疫苗接种并未取得理想效果，因此，高效准确的检测方法对于发病牛的诊断和牛场生物安全防控尤为重要。本研究比对分析了近年流行的BVDV全基因序列，发现BVDV 的3 种基因型差异较大，无法兼顾高灵敏度及全面检出，因此本研究针对国内主要流行的BVDV 基因1 型毒株5′-UTR保守区域设计引物和探针，经过筛选和优化建立BVDV-1 实时荧光定量RT-PCR 检测方法。试验结果表明：该方法具有较好的特异性，最低检测下限为1.7 copies/μL，具有较高的敏感度，变异系数均小于1%，重复性良好。与赵成莹等[12]开展的BVDV RT-PCR 方法相比较，本研究所建立的方法灵敏度更高。张宇名等[13]建立了BVDV 可视化一步RT-LAMP 检测法，可在30 min 内完成检测，对BVDV RNA 检测下限最低达0.021 pg/μL。魏宇等[14]建立了BVDV 和牛冠状病毒双重纳米RT-PCR 检测方法，为常规RT-PCR 敏感性的10倍，最低检出限为l fg。王以欣等[15]制备了BVDV单克隆抗体并应用于病毒检测。BVDV 检测方法不断改进完善，一些新兴技术被应用于BVDV 的检测，如双重纳米RT-PCR 法、RPA-LFD 技术、抗体液相芯片技术、纳米抗体ELISA 和CRISPR等[16-20]。近年来开展的BVDV 检测方法研究为疫病诊断和流行病学调查提供了必要的技术支持。
中国云南边境地区与老挝、缅甸和越南等国有频繁的出入境动物经济贸易，且周边国家兽医防疫体系落后，导致进入中国的动物病毒带毒风险较高，边境地区病毒防控压力巨大。采用本研究所建立的实时荧光定量RT-PCR 方法对云南省5个地区的172 份牛血样进行临床样品检测，检测结果为 33 份样品为 BVDV 阳性，阳性率为 19.19%，与国家标准检测结果一致，说明本研究所建立的检测方法具有较高的准确性，对云南BVDV-1 的流行病学研究和防治具有重要意义。在荧光PCR反应程序中，预变性可使引物完全变性解开，从而保证引物为单链 DNA，提高了扩增效率。1 个高效的目标序列预扩增步骤可以显著提高整体检测灵敏度，在本研究建立的实时荧光定量PCR 反应程序中增加了5 个循环的预扩增程序，灵敏度显著提高，最低可检测1.7 copies/μL 的样本。此外，本研究建立的标准曲线为y=-3.259 9x+40.392 0，相关系数R2=0.998 4，其中y值为Ct 值，x值为拷贝数的log 值。对横坐标参数进行赋值，令x值为0，即样本中BVDV 的模板含量拷贝数为1，得到的最大Ct 值为40.392 0，约等于40。因此，Ct 值40 可作为本方法判定结果的临界值，即Ct 值大于40 即判定为阴性，Ct 值小于40 则判定为阳性，该方法的结果判定更加方便简单。
本研究建立了BVDV 基因1 型实时荧光定量RT-PCR 检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，具备良好的重复性，对牛全血样品BVDV 检出效果较好，能够为BVDV-1 的快速诊断和病毒研究提供有价值的参考。
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