张银龙 杨 红
（1.商丘市中医院骨科，河南 商丘 476000；
2.郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南 郑州 450001）
骨肉瘤作为儿童和青少年人群常见且恶性程度较高的骨原发肿瘤，早期便可出现局部和远隔转移，多数患者确诊时已处于中晚期[1]。尽管现有的手术联合化疗的治疗方法不断改进，骨肉瘤患者生存率有所提高[2]，但高复发、高转移依然是导致患者死亡的主要因素[3]。有研究结果显示，发生复发的骨肉瘤患者5年生存率<20%[4]。因此，深入研究和寻找与骨肉瘤复发和转移相关的机制和敏感基因，已成为骨肉瘤综合防治的重点和难点。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为长度>200 nt，且没有蛋白编码功能的RNA，已被证实参与了染色质重构、组蛋白修饰、细胞周期调控等生物学过程[5]，并且可在转录、转录后、表观遗传等多水平上调控基因表达，影响细胞分化、生长等过程[6]，参与了多种疾病进程，特别是在肿瘤进展中发挥重要作用[7]。锌指结构反义转录本1（zine finger antisense 1，ZFAS1）作为一种lncRNA，参与了多种恶性肿瘤发生、进展过程[8]，但其在骨肉瘤中的作用相关报道较少。本研究拟探讨骨肉瘤患者癌组织中ZFAS1的表达情况，及其与临床病理指标和预后的相关性，以期为骨肉瘤的致病机制研究提供参考。
1.1 研究对象
选取2009年6月—2015年6月于商丘市中医院住院接受手术治疗的骨肉瘤患者101例，其中男54例、女47例，年龄（23.35±8.17）岁。组织学类型中成骨细胞型41例，成纤维细胞型29例，软骨母细胞型14例，混合型17例；
Enneking分期Ⅰ～ⅡA期40例，ⅡB～Ⅲ期61例；
发生转移48例。纳入标准：术前未行放疗、化疗治疗，术后病理检查证实为骨肉瘤，依从性好，临床资料完整。排除标准：合并有其他系统肿瘤，有认知功能障碍和精神疾病史，继发性骨肉瘤，以及患有其他慢性疾病。术中留取所有骨肉瘤患者的癌组织和距离肿瘤边缘>5 cm的癌旁组织，快速置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。本研究通过商丘市中医院医学伦理委员会批准（SQSZYY20081218009），所有患者或监护人均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 癌组织和癌旁组织中ZFAS1相对表达量的检测
取癌组织和癌旁组织，剪碎，研磨至粉末状，加入细胞裂解液，采用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，采用核酸蛋白定量检测仪（美国Eppendorf公司）测定总RNA纯度，以A260nm/A280nm比值1.80～2.10为合格。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa公司）将RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），并以其为模板，采用PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）和CFXConnect实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）进行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），反应条件：95 ℃1 min；
95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，38个循环。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。引物序列：ZFAS1上游引物为5"-CTATTGTCCTGCCCGTTAGAG-3"，下游引物为5"-GTCAGGAGATCGAAGGTTGTAG-3"，大小为96 bp；
GAPDH上游引物为5"-TCCCATCACCATCTTCCA-3"，下游引物为5"-CATCACGCCACAGTTTTCC-3"，大小为163 bp。用2-ΔΔCt法计算癌组织和癌旁组织中ZFAS1相对表达量。根据癌组织中ZFAS1相对表达量的均值，将骨肉瘤患者分为低表达组和高表达组。
1.2.2 随访
对所有患者随访5年，随访形式包括住院期间的查房、出院后门诊复查和电话随访等，截止时间为2020年6月30日，终点事件为死亡，记录患者生存时间，计算5年生存率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用Kaplan-Meier生存曲线分析骨肉瘤患者的生存情况，采用Cox比例风险回归模型分析骨肉瘤患者的预后影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 癌组织和癌旁组织ZFAS1相对表达量的比较
癌组织ZFAS1相对表达量为2.74±0.23，高于癌旁组织（1.01±0.09）（t=71.876，P<0.001）。
2.2 不同临床病理特征的骨肉瘤患者之间ZFAS1相对表达量的比较
不同年龄、性别、组织学类型、肿瘤部位、肿瘤直径和是否病理性骨折的骨肉瘤患者ZFAS1相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），不同Enneking分期、KPS评分、分化程度和有无远隔转移的骨肉瘤患者ZFAS1相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1 不同临床病理特征的骨肉瘤患者癌组织中ZFAS1相对表达量的比较
2.3 癌组织ZFAS1相对表达量与骨肉瘤患者预后的相关性
根据癌组织中ZFAS1相对表达量的均值将患者分为低表达组（54例）和高表达组（47例）。101例患者随访时间为1～60个月，Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，低表达组生存时间为（46.24±2.55）个月，5年生存率为61.11%，均高于高表达组[（26.09±2.76）个月和21.28%]（Log-Rankχ2=22.059，P<0.001）。见图1。
图1 不同ZFAS1相对表达量骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲线
2.4 骨肉瘤患者预后影响因素分析
Cox比例风险回归模型结果显示，Enneking分期、分化程度、远隔转移和ZFAS1表达是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素[风险比（hazard ratio，HR）值分别为2.620、0.384、2.197、1.978，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为1.203～5.706、0.186～0.791、1.131～4.270、1.034～3.784]。见表2。
表2 影响患者预后的多因素Cox比例风险回归分析
骨肉瘤患者因发病早期临床症状不典型且无敏感的生物学标志物，导致多数患者错失最佳治疗时机，患者整体预后不佳[9]。近年来，新辅助化疗药物逐渐被应用于临床，在提高骨肉瘤患者生存率方面发挥了重要作用[10]，但远隔转移和复发仍给患者生存带来严重威胁[11]。随着对骨肉瘤发病机制研究的不断深入，越来越多的研究发现，骨肉瘤组织中存在lncRNA表达谱异常[12]，lncRNA参与了骨肉瘤发生、进展、转移等过程[13]。lncRNA作为一类缺乏开放阅读框架而不具备蛋白编码功能的RNA，位于基因“暗区”，不仅参与了多种疾病的发生[14]，而且与肿瘤发生、进展及预后密切相关[15]。ZFAS1位于人染色体20q13，表达于多种组织和器官中，功能复杂，在多种恶性肿瘤组织中表达异常[16]，且参与了肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、上皮-间质转化等多种过程[17]。本研究结果显示，癌组织ZFAS1相对表达量高于癌旁组织（P<0.001），说明癌组织中ZFAS1呈高表达，可能参与了骨肉瘤的发生过程；
Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、KPS评分<70分、低分化和发生远隔转移的骨肉瘤患者癌组织ZFAS1相对表达量升高，进一步说明ZFAS1可能参与了骨肉瘤的恶性进程。
LI等[18]的研究结果显示，ZFAS1表达上调预示胆管癌患者预后不良。FENG等[19]的研究结果显示，ZFAS1高表达提示子宫颈癌患者预后不良。还有研究结果显示[20]，ZFAS1可作为预测甲状腺癌患者预后的潜在的生物标志物。本研究结果显示，ZFAS1低表达组生存时间和5年生存率均高于高表达组，说明ZFAS1表达水平与骨肉瘤患者预后有关。本研究结果还显示，Enneking分期、分化程度、远隔转移和ZFAS1表达是影响患者预后的独立危险因素（HR值分别为2.620、0.384、2.197、1.978，95%CI分别为1.203～5.706、0.186～0.791、1.131～4.270、1.034～3.784），进一步说明ZFAS1表达与患者预后有关，提示ZFAS1或可作为评估骨肉瘤患者预后的潜在的生物标志物。
综上所述，骨肉瘤患者癌组织lncRNA ZFAS1表达上调，且与恶性进展病理指标和患者预后相关，但其在骨肉瘤中的具体作用机制尚待进一步研究。
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