翟子惠， 苏俭生
（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔修复科，上海 200072）
龋病是口腔常见的慢性感染性疾病，人们普遍认为牙菌斑相关菌群是该病的始动因子[1]。其中，变形链球菌（S.mutans）是主要病原菌之一[1]。S.mutans从蔗糖中合成大量葡聚糖和其他胞外聚合物（extracellular polysaccharides, EPS）的能力和将多种碳水化合物转运和代谢为有机酸的能力使其具有较强的抵抗力。而研究[2]表明，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）具有在体外抑制S.mutans的活性、产酸及耐酸性的作用，葡聚糖水解酶消化EPS基质中的糖基键会改变生物膜的硬度，促使去除成熟生物膜[3]。但二者均受剂量和作用时间的限制，目前应用的收效甚微[4]。
近年来，研究人员利用纳米囊泡充当载体，负载抗菌药物以促进抗生素的生物利用度[5]。由苯硼酸与聚乙烯亚胺合成的聚合物纳米囊泡在酸性条件下可以达到触发机制，并具有定点释放等功能。因此，本研究旨在构建包裹EGCG和葡聚糖水解酶形成稳定结构的纳米囊泡，同时探究其对S.mutans生长的影响。
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与仪器 4-（溴甲基）苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）、葡聚糖水解酶、EGCG和 D-（+）-葡萄糖（Sigma公司，美国），聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）和三乙胺（阿拉丁公司，中国），噻唑蓝溴化四唑（thiazolyl blue，MTT）试剂盒（生工生物工程公司，中国），二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）试剂（Solarbio公司，中国），脑心浸液肉汤（brain-heart infusion，BHI）培养液（康润公司，中国）。
磁力搅拌器（Isotemp公司，中国），超微量紫外分光光度计（Thermo公司，美国），Zetasizer Nano ZS粒度分析仪（Malvern公司，美国）。
1.1.2 菌株与培养条件S.mutans菌株（ATCC25175）于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）购入。细菌在 37 ℃、5%CO2条件下培养至对数生长期。各实验均设3个平行样本，重复3次。
1.2 实验方法
1.2.1 纳米囊泡的合成 将摩尔比为90∶1的PBA与PEI溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，另加入敷酸剂三乙胺，油浴温度70 ℃，搅拌24 h。反应结束后，将产物分别在DMSO和去离子水中充分透析，得到PBA-PEI复合物。将EGCG溶解于去离子水中，与葡聚糖水解酶在室温下旋转搅拌反应2 h，将得到的多酚蛋白复合物与PBA-PEI按照固定质量比[6]进行投放，用去离子水稀释，控制pH值为7.0，以500 r/min的转速旋转1 h得到淡白色澄清液体，过滤后得到目标产物，命名为P1。
1.2.2 纳米囊泡粒径及形貌表征 将10 μL适量浓度的样本滴于铜网静置，吸去上层溶液。再取10 μL 2%乙酸双氧铀点在铜网，静置后吸去，在透射电子显微镜（TEM）下分析观察。使用动态光散射仪（dynamic light scattering，DLS）评估 P1的粒径分布、Zeta电势（Zeta potential）和多分散指数（polydispersity index，PDI）。
1.2.3 载药、包封及酶活性研究 取梯度浓度EGCG液体于紫外分光光度计下测定紫外吸光度，绘制EGCG浓度-吸光度值标准曲线。取200 μL P1于300 kDa超滤管中超滤。取2 μL超滤后的溶液，加入稀盐酸至pH值为5，静置24 h后取2 μL溶液，于紫外分光光度计下测定274 nm处的吸光度值，计算溶液药物含量，用公式计算P1的EGCG载药率（loading content，LC）及释放率（release rate，RR）。
LC（%）=纳米囊泡中装载的药物总量/载药纳米囊泡总质量×100%
RR（%）=纳米囊泡释放的药物总量/纳米囊泡装载的药物总量×100%
取葡萄糖配制成不同标准浓度，另取40 kDa的葡聚糖20 μL（10 mg/mL），加入不同浓度的葡聚糖水解酶反应2 h，同时加入DNS试剂沸水浴煮沸5 min，冷却后检测540 nm处的吸光度值，绘制葡萄糖-吸光度值标准曲线及水解酶-吸光度值标准曲线。取超滤后pH值为5的5 μL溶液加入至20 μL葡聚糖水解酶，同样方法测吸光度值，计算活性酶含量。根据EGCG与水解酶的摩尔比计算出酶释放含量，用公式计算P1的酶活性（enzyme activity，EA）。
EA（%）=纳米囊泡中释放的有活力酶含量/纳米囊泡中释放的酶总量×100%
1.2.4 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 最小抑菌浓度（MIC）是指完全抑制细菌生长的药物浓度。MTT是测定细菌活性的有力试剂，利用其可测定MIC[7]。最小杀菌浓度（MBC）是指能够完全杀灭细菌的最小抗菌剂浓度。将1×109cfu/mL的细菌培养物（10 μL）接种到含有 P1（4～40 μg/mL）的1 mL BHI培养液中；
设立对照组（control）：未添加P1溶液；
设立空白组（0）：仅有BHI培养液。将培养12、24 h的100 μL溶液离心后重悬于96孔板中，加入MTT（各10 μL），孵育4 h后于酶标仪下测量吸光度值，判定S.mutans的生长抑制情况。挑选合适组别进行菌液连续稀释，用平板菌落计数法计算S.mutans的 MBC。
1.2.5 pH值的检测 将1×109cfu/mL的细菌培养物（10 μL）接种到含有 P1（4～40 μg/mL）的 1 mL BHI培养液中。在37 ℃下生长24 h及72 h，摇匀后各吸取10 μL，滴定于pH试纸上，观察pH值。
1.2.6 数据分析 采用Graphpad Prism 9 软件进行数据分析，2组间比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 纳米囊泡的大小和形态
TEM结果显示，P1为均匀规则的球形（图1A）。为了获得纳米囊泡最佳的粒径和分散度，实验中考察了原材料不同投料比下形成的P1表征差异，综合考虑后在分散度最小（0.202）时，选择PBA-PEI∶葡聚糖水解酶∶EGCG=30 mg∶28.08 mg∶2.07 mg的投料比，此时EGCG与葡聚糖水解酶的摩尔比约为10∶1，Zeta电势为 34.2 mV（图 1B），纳米囊泡粒径平均为100.4 nm（图1C），分散度为0.202。不同投料比下形成的P1表征差异结果（表1）显示，在其他条件不变的情况下，随着EGCG和葡聚糖水解酶含量的增加，分散度先增加后降低然后再增加，而粒径则逐渐增加。
图1 P1的纳米表征Figure 1 Nano-characterization of P1
表1 不同投药量对纳米囊泡特征的影响Table 1 Effects of different dosages of P1 on the characteristics of nanovesicles
2.2 包封率、释放率和释放前后的酶活力
经测定，2 mL（2 mg/mL）的P1内含有102.95 μg的EGCG，LC=74.06%。在pH值为5时，EGCG的24 h释放量为38.67 μg，RR=37.56%。此时根据比例计算，酶含量为563.7 μg，而测得活性酶含量为144 μg，24 h EA=25.54%。
2.3 MIC和MBC分析
通过MTT法测定合成的P1纳米囊泡对培养24 h和72 h后S.mutans代谢活性的抑制作用。由图2A所示，培养24 h后，与control组相比，12 μg/mL P1溶液里的S.mutans明显被抑制（P＜0.001）；
32 μg/mL 时的吸光度值与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）。图2B示，培养 72 h后，12～20 μg/mL P1溶液里的S.mutans仍有活力，能继续生长，24 μg/mL时的吸光度值开始与 control组有差异（P＜0.01），而32 μg/mL时仍能保持与空白组的差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果说明，纳米囊泡P1溶液浓度达到24 μg/mL时，其对S.mutans的增殖有一定的抑制作用，视为 MIC=24 μg/mL。
图2 MTT法测定不同浓度P1溶液的吸光度值Figure 2 The MTT method determined the absorbance value of different concentrations of P1 solution
经MTT法分析，选取4组进行平板涂布，分别为 12、24、32 μg/mL 的 P1 溶液组和 control组，如图 3所示。当P1浓度为32 μg/mL时，平板无S.mutans，视为 MBC=32 μg/mL。
图3 不同浓度P1溶液中平板菌落分布Figure 3 Plate colony distribution of different concentrations of P1 solution
2.4 共培养导致的pH值的变化
在24 h和72 h的培养时间下，不同浓度的P1溶液会导致S.mutans的培养环境差异很大。如图4所示，control组pH值保持在5.0～6.0，为酸性环境，表明S.mutans可以产酸并且耐酸。而P1溶液浓度超过 28 μg/mL（24 h）和 8 μg/mL（72 h）时，pH 值为7.0，转为中性溶液，说明在此环境下，S.mutans失去产酸能力。
图4 培养液在0～32 μg/mL P1浓度下pH值的变化Figure 4 Changes of pH value of the medium at concentrations of 0-32 μg/mL P1
S.mutans是龋病的主要致病菌之一。S.mutans产生和分泌大量的乳酸，酸性环境下牙本质脱矿，最终使得龋病发生和发展[1]。S.mutans形成生物膜的能力很重要，特别是水不溶性葡聚糖，介导的黏附S.mutans和其他口腔细菌定殖于牙齿表面，进而形成牙齿表面生物膜[1，8]。所以，想要通过抗菌药物来抑制S.mutans的活性，需要具有瓦解葡聚糖的能力。长期使用抗生素可能会导致多重耐药菌株的出现，而新型抗生素的开发进展缓慢[9-10]。因此，寻找替代的方法变得至关重要。
近年来，纳米囊泡逐渐被运用于抑制或杀灭细菌。它因高表面积/体积比的特性，可以充当抗菌剂或负载抗菌药物的载体，以促进抗生素的生物利用度和有效性。在特定条件下纳米囊泡机制被触发，释放抗菌药物，达到靶向治疗、定点释放的功能[11-13]。葡聚糖水解酶蛋白质表面的邻苯二酚基团可以和修饰了苯硼酸的阳离子高分子载体结合，通过形成动态化学键形成纳米囊泡（P1），化学键在酸性条件下断裂，将内容物释放出来作用于靶向细胞并保持蛋白质的活性[6]。本实验通过筛选合成了最优投料比的纳米囊泡复合物（P1），通过TEM可以看出纳米囊泡呈规则球形囊泡，包裹着EGCG和水解酶复合物。DLS测量的粒径均值为100.4 nm，此时的粒径比S.mutans的生物膜孔隙小得多，因此具有良好的穿透效果[14]。Zeta电势可以用来表示聚合物的分散稳定性[15-16]。本研究的Zeta电势结果证明，实验合成的纳米囊泡P1电势稳定、不易解离。此外，带正电荷的P1在生物膜内积累，可以与释放的药物一起杀死更多的细菌[17]。P1材料包封率可达74.06%，具有良好的包封效果。当pH值调节至5后，24 h内P1内负载的药物仅缓慢释放了37.56%，这表明合成的纳米囊泡中仍保留较多的药物复合物[18]。
S.mutans能产生大量乳酸，致使局部环境的pH值降低。P1稳定的化学键可在低pH值环境下断裂，将内容物释放。体外实验中，P1在浓度为24 μg/mL时即有显著的抗菌作用；
持续72 h后，P1在32 μg/mL浓度时，仍对S.mutans的活性有抑制作用，说明P1在低pH值条件下，其有效释放时间超过72 h。EGCG的抗菌机制为对微生物细胞质膜的不可逆破坏，同时破坏了整个细胞膜的pH值[19]，进而可能触发了细胞的一系列生理效应。S.mutansEPS基质中，在葡糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）作用下生成的葡聚糖是其重要的支架机构。葡聚糖水解酶的作用大大改变了生物膜的硬度，极大地促进了成熟生物膜的去除[20]。同时，葡聚糖水解酶致使S.mutans局部环境pH值的升高，加大了S.mutans的存活难度，也防止其他后继细菌的定殖和形成复杂的生物膜。EGCG与葡聚糖水解酶的同时应用既能够抑制细菌活性，又能解决单独使用天然抗菌药物水解酶低吸收、活性不稳定的问题。
综上所述，本研究成功构建了一种同时包裹EGCG和葡聚糖水解酶复合物的纳米囊泡，其能形成稳定的结构。在细菌生物膜微环境pH值降低时，纳米囊泡内负载的酶和药物被缓慢释放，产生的抗菌作用能改变局部环境的pH值，达到更好的抑菌作用。本研究所用的纳米囊泡可用于漱口液、牙膏和其他口腔卫生产品中。在后续研究中，可寻找抗唾液冲刷作用的载体，搭载本研究的纳米囊泡，进行下一步实际运用的研究。
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