宋世文，宋晓仪，唐淑军，曾定玲，文冠希，梁 幸
（深圳市质量安全检验检测研究院，深圳 518101）
克伦特罗通常用于治疗支气管炎，又曾被用作动物养殖的促生长剂，提高动物的瘦肉产率。莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗等β-受体激动剂，与克伦特罗具有类似作用。在利益驱动下，将β-受体激动剂类药物用于动物养殖，给食品安全带来很大隐患［1］。为了确保动物源性食品安全，农业农村部176 号文件明确规定禁止将克伦特罗等β-受体激动剂用于动物养殖［2］。
β-受体激动剂类药物的测定主要用精密仪器通过多个过程提取净化，可以实现高准确率和高灵敏度，如液相色谱串联质谱仪，缺点是用时较长，单个样品成本高，难以实现大量样品检测。分子印迹固相萃取通过空间形状、孔穴大小以及识别位点对目标分析物进行识别，能够实现选择性萃取和富集目标物克伦特罗的测定，方法具有很高的灵敏度、稳定性和可靠性［3］。
研究应用MIT 固相萃取柱净化和富集猪尿液中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗等β-受体激动剂，利用其选择性强和灵敏度高的特点，采用10 个单样组成混合样品先筛选，再对阳性混合样品进行单个检测，该方法有较低的检出限和较高的精密度，能对猪尿液中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗进行准确的定性和定量分析。该方法准确率高、快速，特别适合阳性率较低和检测量大的情形应用。
1.1 仪器与试剂
5500 QTRAP 串联质谱仪（美国AB Sciex 公司）、ACQUITY UPLC 超高效液相色谱、固相萃取装置、Oasis TM MCX 固相萃取柱（美国Waters 公司）；
3-30K 台式高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；
Supel MIP SPE（β-agonists，25 mg∕10 mL，65 μm，美国Sigma 公 司）；
Affinilute MIP-SPE（β-agonist，EUBiotage 公司，25 mg∕10 mL）；
J2 全自动固相萃取浓缩仪（美国J2 公司）。
甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck 公司）；
甲酸为色谱纯（北京迪马科技有限公司）；
乙酸为分析纯（上海润捷化学试剂有限公司）；
乙酸铵、氨水（NH3含量25%～28%）均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；
克仑特罗（clenbuterol）、莱克多巴胺（ractopamine）、沙丁胺醇（sblbutamol）、西马特罗（Bambuterol，纯度＞98%）等标准物质购自农业农村部环境保护科研监测所，浓度100 mg∕L；
乙二胺-N-丙基硅烷吸附剂（PSA）粒径40～60 μm、C18粉40 μm（美国Agilent Tech）。
1.2 标准溶液的配制
准确量取100 mg∕L 标准物质用甲醇定容稀释至10 mg∕L 混合标准物质，再用甲醇定容稀释为0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg∕L 的混合标准工作液。
1.3 液相色谱-质谱条件
1）色谱柱。Acquity LC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，17 μm，美国Waters 公司）；
柱温40 ℃；
流速0.3 mL∕min；
进样量5.0～10.0 μL；
流动相为甲醇（A）和0.05%（V∕V）甲酸水溶液（B）。梯度洗脱程序：0～2.0 min，10%～40%A，3.0～4.0 min，40%～90%A；
4.0～4.1 min，90%A；
4.1～4.2 min，10%～90%A；
4.2～6.0 min，10%A。
2）离子源。电喷雾离子（ESI）源；
正离子模式；
检测方法为多反应监测模式（MRM）；
电喷雾电压正离子5 500 V；
离子源温度500 ℃；
雾化气0.41 MPa辅助加热气100∶0.31 MPa；
辅助加热气2∶0.34 MPa；
气帘气0.21 MPa。
1.4 样品准备
1）单样品准备。取猪尿样品50 mL，用乙酸（5%）和氢氧化钠（5%）调节pH 至7.0，以5 000 r∕min离心5 min ，取上清液备用。单样品是用于单个样品的定性定量检测。
2）混合样品准备。移取5 mL 待测单样品上清液，10 个单样品混合成一个混合样品。混合样品用于最多10 个样品同时定性定量检测，对检测呈阳性混合样品，再对单个样品进行检测。
1.5 样品预处理
依次用3 mL乙醇、3 mL去离子水、3 mL 50 mmol∕L乙酸铵（pH 6.7）活化MISPE 柱；
移取5 mL 猪尿混合样品（2 mL 猪尿单样品），加入50 mg∕mL 的PSA 粉和C18 粉，旋涡3 000 r∕min 混匀3 min 放置5 min，取上清液上样过柱；
依次用3 mL 去离子水、3 mL 乙腈、2 mL 0.5%（V∕V）乙酸∕乙腈溶液淋洗，用洗耳球挤干溶液；
用5 mL 10%（V∕V）乙酸∕甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用洗耳球挤干溶液；
于50 ℃水浴下氮气吹至近干，用0.5 mL 0.1%（V∕V）甲酸水∕乙腈（9∶1，V∕V）复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。液相色谱进样量混合样品10 μL（5 μL 单样品）。此过程也可用J2 全自动固相萃取浓缩仪完成。
2.1 仪器条件优化
为提高4 种β-受体激动剂检测的选择性和灵敏度，优化检测离子对和检测条件，以达到稳定性和灵敏度的统一。4 种β-受体激动剂类药物的保留时间及离子对优化质谱参数见表1。
表1 4 种β-受体激动剂类药物的保留时间及离子对质谱参数
2.2 净化效果比较
尿液组成复杂，含有大量尿酸、尿嘧啶和蛋白质等杂质；
同时动物个体差异也导致尿液基体组成变化较大；
因此，尿液样品基质干扰是影响β-受体激动剂测定的重要因素，进而影响分析检测的灵敏度和准确性。为了更好的净化效果，比较了3 种固相柱的净化效果，即Sigma-MIT、Biotage-MIT 与MCX固相萃取的净化效果，4 种β-受体激动剂在尿液中的添加浓度为0.1 μg ∕L，用混合样品法测定，重复6 次，通过固相柱萃取净化后，应用LC-MS-MS 测定，得到4 种β-受体激动剂的信噪比（表2）。信噪比高，表示净化效果好，检出限低。由表2 可知，Sigma-MIT 固相萃取能有效地消除尿液样品基质对4 种β-受体激动剂的影响，信噪比最高，其他2 种固相柱只有接近或不到Sigma-MIT 的50%。用变异系数代表稳定性，变异系数低，表示稳定性高。由表2可知，Sigma-MIT 固相萃取对4 种β-受体激动剂的稳定性最优，其他2 种都在124%和170%以上，因此选择Sigma-MIT 净化（表2）。
表2 3 种固相萃取柱净化效果的比较
2.3 方法的定量限和线性范围
单样品添加浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 μg∕L；
多样品添加浓度为0.01、0.02、0.05、1.00、5.00 μg ∕L；
其中最低浓度重复6 次，其他浓度重复3 次。
该方法的特点是较当前国标（农业农村部公告1063 号）LOQ更低，其中单样品法比国标降低75%，为0.1 μg∕L，多样品法比国标降低95%，为0.01 μg∕L（表3），表明该方法可以进行多样品混合检测［4，5］。
表3 方法的检出限和线性范围
2.4 方法的回收率和精密度
单样品添加浓度为0.1、0.2、5.0 μg∕L；
混合样品添加浓度为0.01、0.02、1.00 μg∕L；
每个梯度重复6次。4 种β-受体激动剂加标回收率和精密度见表4和表5。不同加标浓度下，加标回收率为61.2%～99.6%；
精密度为4.9%～18.7%，该方法准确性和稳定性良好。
表4 单样品添加回收率和精密度
表5 混合样品添加回收率和精密度
2.5 方法应用效率
根据深圳市市场监督管理局2019 年网上公开资料［6］，2019 年畜禽产品1—9 月抽检3 601 个样品，检测β-受体激动剂、磺胺、硝基呋喃3 类20 个项目，发现超标样品22 个，超标率为0.61%。其中，β-受体激动剂超标率小于0.1% 。根据农业农村部公开信息［7］，2021 年抽检畜禽样品22 127 份，检测项目18 项，总超标率为1.2%，β-受体激动剂超标率小于0.1%。深圳市宝安区2018—2021 年4 年共检测畜禽产品384 个，检测β-受体激动剂、磺胺、四环素类、喹诺酮类4 类18 个项目，累计超标样品15 个，超标率为3.9%；
超标样品主要是四环素类和喹诺酮类，未见β-受体激动剂类物质超标。可见，β-受体激动剂超标率较少，不到0.1%。
在实际检测中，对超标率小于0.1%的情形，1 000 个单样品可以组成100 个混合样品，由于阳性率小于0.1% ，只需1 个混合样品重新检测，所以相当于检测1 000 个单样品，只需要检测110 次（100 个混合样和10 个单样），该方法效率是通常方法检测的9.1 倍。对超标率小于1%的样品，100 个单样品可以组成10 个混合样品，共需检测20 个样品（10 个混合样品和10 个单样品），效率是普通检测的5 倍。该方法适用于超标率不高的大量样品使用。
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