沈烨， 王子懿， 汪文平， 许文荣
(1. 江苏大学附属澳洋医院普外科，江苏 苏州 215600；
2. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)
常见消化道肿瘤包括食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌等，根据2022中国癌症统计[1-2]，结直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌分别位列中国癌症发病率的第2、3、4、6位，同时在中国癌症死亡率中分列前5位，严重威胁着人类健康。因此，早诊断、早干预、早治疗是消化道肿瘤个体化治疗的迫切需求。
目前，小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEV)正成为肿瘤诊疗临床转化研究的热点。直径<200 nm且具有脂质双分子层的sEV主要成分中包含外泌体(exosomes)，在体液中丰度较高，内部富集蛋白质、脂质和各类核酸分子及代谢物，这些分子具有来源细胞的特异性，因此，分析临床样本中sEV的种群大小、数量、理化成分变化等，将有助于阐明其来源肿瘤细胞的表型及其生物学作用，反映肿瘤的发生发展过程[3-4]。此外，sEV携载特异性分子的药物递送系统有助于解决肿瘤治疗中的特异性和靶向性问题，从而提高生物利用度、减少抗癌药物的毒性次级效应，表现出更佳的肿瘤靶向干预和增强药物治疗的效果[5]。
肿瘤来源的sEV参与调控肿瘤细胞侵袭迁移、促进血管生成、调节肿瘤干细胞特性和肿瘤微环境、影响肿瘤耐药等消化道肿瘤发生发展过程[6]。例如，肝癌细胞衍生的sEV可被脂肪细胞主动内化，诱导产生炎症表型，并在小鼠异种移植模型中观察到肿瘤sEV处理的脂肪细胞可促进肿瘤生长，增加血管生成，并招募更多的巨噬细胞[7]。肝癌细胞分泌的sEV中miR-103通过靶向多个内皮连接蛋白增加血管通透性，促进肿瘤转移[8]。肿瘤来源的外泌体miR-1247-3p直接靶向β-1,4半乳糖基转移酶Ⅲ，激活整合素β1-NF-κB信号通路，诱导癌症相关成纤维细胞活化，促进肝癌的肺转移[9]。
在胃癌细胞模型和小鼠腹膜肿瘤模型中发现，胃癌患者恶性腹腔积液sEV可促进上皮-间充质转化信号通路[10]。在表达上调的胃癌患者血浆外泌体circRNA分子中，ciRS-133表达与棕色脂肪水平呈正相关，细胞来源外泌体可传递ciRS-133至前脂肪细胞，通过海绵miRNA-133上调PRDM16表达从而促进棕色样细胞分化，参与胃癌恶病质[11]。
一项女性食管癌研究报道[12]，干细胞样细胞分泌的sEV中性别依赖的lncRNA FMR1-AS1通过激活TLR7-NFκB-c-Myc信号通路来维持干细胞样细胞动态转换状态，进而促进FMR1-AS1介导的食管癌细胞重编程作用。
顺铂和紫杉醇可通过激活泛素特异性蛋白酶7/异质核核糖核蛋白A1轴促进肿瘤微环境中癌症相关成纤维细胞分泌sEV-miR-522，抑制花生四烯酸盐脂氧合酶15，最终导致胃癌产生获得性化疗耐药[13]。lncRNA前列腺雄激素调节转录本1(PART1)通过调节miR-129/Bcl-2信号通路促进食管癌吉非替尼耐药，并通过sEV传播吉非替尼耐药性[14]。
目前临床常规采用的肿瘤筛查与诊断指标仍为血清中蛋白类分子，其特异性及敏感性均不高[15]，但蛋白组学技术的发展使得血液外泌体中肿瘤蛋白类标志物的特异性和敏感性均可达到90%以上[16]。而随着分离检测技术的发展，sEV中的各种遗传信息作为诊断标志物越来越受到关注[17]，在生物信息学技术的辅助分析下不断挖掘sEV中富集的miRNA、lncRNA、circRNA、tsRNA等高特异性和敏感性的标志物(表1)，且检测方法也不断优化。
表1 消化道肿瘤中sEV分子标志物与临床诊断相关性
2.1 蛋白类标志物
现已发现多种消化道肿瘤sEV来源的蛋白类分子标志物。例如，sEV中的S100A4通过激活STAT3磷酸化上调骨桥蛋白表达，从而促进肝癌转移，这表明S100A4可作为肝癌转移的预后标志物[34]。结肠癌患者血清sEV中热休克蛋白40家族蛋白DNAJB8高表达，除与较低的总生存期和无病生存期相关以外，还可作为奥沙利铂耐药的标志物[35]。
血清sEV中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)可以有效鉴别早期胰腺癌与良性胰腺疾病[35]。Li等[36]利用分层表面增强拉曼散射底物和快速富集策略磁珠@外泌体@SERS检测探针构建了一个高灵敏度的检测系统，并基于外泌体蛋白质组学分析选择富亮氨酸α2糖蛋白1(leucine-rich α2-glycoprotein 1,LRG1)+外泌体(LRG1-Exos)和GPC1+外泌体(GPC1-Exos)为标志物组合，直接定量检测临床样本中的特异性外泌体，结果显示胰腺癌的诊断效率显著提高，曲线下面积(area under curve,AUC)为0.95。
2.2 miRNA分子标志物
miRNA是肿瘤sEV相关研究报道中常见的标志物。例如，结直肠癌患者血清sEV中miR-17-92a高表达与复发相关，miR-19a高表达则与预后差相关[25]。食管癌患者组织和血清sEV中miR-339-5p低表达，且与放疗敏感性相关，故可预测局部晚期食管癌术前放疗的病理反应[19]。
越来越多的研究报道将这些特异性标志物检测方法与计算机功能进行合理组合，可获得更优异的诊断效能。例如，一项胰导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)多中心研究挖掘并设计了8个sEV-miRNA的检测Panel，可诊断PDAC各个阶段，尤其是对Ⅰ和Ⅱ期PDAC的诊断效率较高(AUC达0.93)[31]。
2.3 lncRNA分子标志物
lncRNA主要通过影响肿瘤增殖、迁移、耐药、促进血管生成等方式参与调控[6]，因此，消化道肿瘤sEV内的lncRNA分子同样具有重要的诊断应用价值。例如，血浆sEV内lncRNA-GC1作为胃癌早期检测指标具有较高的诊断效能(AUC达0.90)[37]。食管癌患者血清sEV中lncRNA PART1的表达水平可用于吉非替尼疗效的评估指标[14]。肿瘤相关巨噬细胞sEV内lncRNA CRNDE表达上调，并通过肿瘤相关巨噬细胞来源的sEV转移到胃癌细胞中，促进PTEN泛素化，降低了顺铂敏感性，故可作为顺铂耐药的预测标志物[23]。
2.4 circRNA分子标志物
近年来，circRNA分子因其稳定的生物学特性和在体液中较高的丰度成为肿瘤标志物的研究热点。肝癌患者血清sEV中circTMEM181与抗PD-1耐药相关，通过上调巨噬细胞中CD39的表达，进而协同肝癌细胞中CD73激活细胞外ATP-腺苷通路，促进免疫抑制和抗PD-1耐药性[30]。胃癌患者组织和血清sEV内circSHKBP1高表达与TNM晚期和低生存率相关，通过miR-582-3p/HUR/VEGF路径抑制HSP90降解，从而促进胃癌进展，胃癌术后sEV内circSHKBP1低表达，故可用于胃癌诊断和预后评价的生物标志物[24]。
目前已有学者在开发系统而全面的生物标志物液体活检方法用于肿瘤早期检测，Roy等[38]构建了血清8种circRNA生物标志物组合，其特异性和敏感性均优于经典的胃癌诊断标志物，不仅能够早期检测胃癌患者，而且可以与其他胃肠道肿瘤进行鉴别。
2.5 tsRNA分子标志物
随着高通量测序技术和生物信息学的应用，转移RNA(transfer RNA,tRNA)衍生的小RNA(tsRNAs)被发现参与调控基因沉默、RNA稳定性、逆转录和蛋白质翻译等过程，与细胞增殖、凋亡等相关。食管癌患者唾液sEV中特异性富集tRNA-GlyGCC-5，不仅具备诊断和预后标志物的潜力，而且能用于评估患者从辅助治疗中获益的可能性[21]。肝癌患者血浆sEV中4种tsRNA(tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5和tRNA-GluCTC-5)水平显著升高，可作为肝癌诊断标志物[39]。
目前，天然或者工程化修饰的sEV正被广泛用于治疗难治性肿瘤，这是因为sEV可能富集与免疫治疗、靶向治疗、放化疗等耐药相关的特异性分子，将其作为靶点则可能会增强疗效。另一方面，sEV具有作为纳米载体可介导细胞间信息传递的特性[40]，故而对其工程化携载特异性分子以期优化靶向性，从而改善预后(图1)。
图1 sEV应用于临床治疗常见策略
3.1 sEV与靶向治疗策略
迄今，靶向治疗策略主要有3类设计：① 采用siRNA或过表达直接靶向作用于sEV中特异性分子，阻断肿瘤生长；
② 利用间充质干细胞作为药物递送系统的生物材料，携载特异性分子或药物，提高靶向性，增加肿瘤内药物有效浓度；
③ 利用肿瘤组织来源的sEV对其亲本细胞具有内在的趋向性，改变肿瘤细胞生长环境刺激sEV分泌，提高亲缘细胞对sEV的摄取率，并对重编程sEV进行工程化，从而改善疗效。
circRNA-SORE通过sEV转运在肝癌细胞中传播索拉非尼耐药性，Xu等[41]对不同的肝癌小鼠模型注射siRNA沉默circRNA-SORE，发现可以显著抑制索拉非尼的耐药性，为缓解晚期肝癌患者索拉非尼耐药提供了潜在策略。
Zhou等[42]认为胰导管腺癌免疫治疗的关键在于诱导更多的瘤内效应免疫细胞及逆转免疫抑制，故设计了一种基于外泌体的双传递生物系统，使用骨髓间充质干细胞sEV负载半乳糖凝集素-9siRNA并在表面饰以奥沙利铂前药，构建成一个免疫原性细胞死亡触发器。在该传递系统作用下，破坏半乳糖凝集素-9/dectin1轴，逆转M2样肿瘤相关巨噬细胞的肿瘤免疫抑制作用，募集细胞毒性T淋巴细胞和下调Treg细胞，诱导抗肿瘤免疫，从而增强PDAC免疫治疗的效果。
Xu等[43]基于无铜的点击化学方法对分离的外泌体进行荧光标记，这不仅为点击化学和sEV摄取研究提供了一种简单可靠的表面修饰方法，并可作为临床前sEV肿瘤治疗合理化设计方法的基础。Gong等[44]将亲水光敏剂与胃癌细胞在低pH环境下共培养，将所获sEV装载多柔比星，这种智能药物递送平台不仅能提高靶向性，还能在近红外辐射下解构sEV，释放化疗药物，为联合光动力学治疗提供思路。
3.2 sEV与放化疗策略
放化疗作为传统治疗方案最大的挑战是随着肿瘤的进展而产生耐药性。近年来，在高通量测序技术和生物信息学技术的应用中，发现sEV中富集与放化疗敏感性相关的特异性分子，这为临床增强放化疗效果提供了新的思路。例如，食管癌患者组织和血清sEV中miR-339-5p低表达，且在食管癌细胞的放射耐药亚群中下调，miR-339-5p通过靶向Cdc25A来介导放射敏感性，故可通过干预sEV中miR-339-5p水平提高放疗效果[19]。结肠癌患者奥沙利铂耐药可能的作用机制在于sEV介导的DNAJB8抑制TP53的泛素化降解，导致MDR1上调，因此DNAJB8可作为干预奥沙利铂耐药的治疗靶点[34]。
3.3 sEV与其他治疗策略
除了靶向治疗和放化疗以外，肿瘤疫苗的研究也有进展。研究发现树突细胞来源的外泌体(dendritic cell-derived exosomes,DEXs)形成了一种新的肿瘤免疫治疗疫苗，富含甲胎蛋白的DEXs可以触发强大的抗原特异性抗肿瘤免疫反应，重塑肝癌小鼠的肿瘤微环境，从而为肝癌免疫治疗提供了一种无细胞疫苗选择[45]。
尽管sEV的分离和检测技术尚存在差异化，但基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学与生物信息学技术的应用使得sEV中标志物具备了早期诊断标志物的潜力，更多研究则为临床建立特异性检测Panel提供了依据。此外，新的检测技术也在不断开发，如ExoSD芯片技术对胃癌早期患者血清样本的检出率可达70%[46]。
肿瘤异质性是临床肿瘤诊疗中的挑战，sEV也可能通过信号传导促进肿瘤异质性的发生[40]。因此，在选择外泌体作为肿瘤诊断与预后监测的分子标志物时应考虑到肿瘤异质性的发生机制。
天然或者工程化修饰的sEV被视为一种新的肿瘤靶向治疗理想的工具，体外实验和动物实验结果在药物递送系统设计和优化放化疗方案方面均展示了良好的应用前景，但在治疗时应考虑sEV的给药剂量，因为不同的剂量可能会引起不同的生物效应，此外，机体对sEV的清除作用及其异质性增加了确定精确应用剂量的难度[17]。
总之，sEV作为机体自然分泌的稳定存在的成分，富含特异性遗传信息，可用于消化道肿瘤的筛查、诊断、预后和疗效评估，在经过特定修饰后可提高治疗的靶向性，增强药物的有效性，在深入研究的基础上，应尽快推动其临床转化应用研究。
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