许莉敏，谢燕
糖尿病肾病（DKD）是由糖尿病引起的微血管并发症，以持续白蛋白尿和肾小球滤过率降低为主要特征［1-2］。DKD是导致终末期肾功能衰竭的重要病因之一，约占所有病因的30%，在发达国家中，DKD已经成为尿毒症发生的主要影响因素［3］。肾小球滤过率估计值（eGFR）及24 h尿白蛋白排泄率（24 h UAER）是临床评估DKD患者肾功能及病程分期的常用指标，但2个指标对DKD疾病早期诊断价值有限。既往研究显示，DNA甲基化与DKD有关，而DNA甲基转移酶1（DNMT1）是DNA甲基化的主要催化酶，能够将甲基转移到基因组DNA胞嘧啶核苷酸，负责DNA复制后的甲基化修饰，与人类发育异常、肿瘤及糖尿病等有关［4］。白细胞介素（IL）-6是重要的促炎细胞因子，可通过结合细胞表面的IL-6受体α，促进组织炎症反应的发生。研究表明，DNMT1能够促进脂多糖诱导的促炎细胞因子如IL-6和IL-8的表达，从而激活组织炎症反应，加速DKD的疾病进展［5］。本研究旨在探讨不同疾病严重程度的DKD患者DNMT1和IL-6的水平差异及其在DKD诊断中的应用价值。
1.1 一般资料 选取2020年1月—2021年4月于苏州大学附属第一医院就诊的DKD患者150例（DKD组），DKD诊断标准符合《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南》［6］。纳入标准：心、肾、肺等重要脏器功能良好；
沟通能力良好，可独立完成研究；
配合医师治疗。排除标准：1型糖尿病、肝源性糖尿病、应激性糖尿病、胰源性糖尿病及生长抑素瘤、醛固酮瘤等导致的糖尿病；
合并血液性系统疾病；
合并精神疾病；
妊娠期；
长期酗酒；
临床资料不完整致分组复杂性增加的患者；
本研究期间正在接受其他研究的患者。另选取同期健康体检者50例为对照组，2组研究对象的年龄、体质量指数（BMI）、性别、文化程度和吸烟史（目前正在吸烟或持续吸烟史≥6个月且≥1支/d）差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究严格按照《赫尔辛基宣言》中的医学研究伦理原则（伦理批号：TJ⁃IRB20191222）。
1.2 研究方法
1.2.1 观察指标 收集DKD患者入院后及对照组健康查体时的总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血肌酐、空腹血糖等实验室检查指标。应用改良的MDRD公式计算eGFR=186×（血肌酐/88.4）-1.154×年龄-0.203×0.742（女性）。放射免疫法检测24 h UAER。微柱层析法测定糖化血红蛋白。
Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups表1 2组基线资料比较
1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-6水平 清晨空腹状态下抽取静脉血4 mL并置于无菌真空促凝管中，常温放置20 min，3 000 r/min离心15 min，离心半径11 cm，上清液置于-80℃冰箱保存。ELISA法检测血清IL-6水平，试剂盒购自武汉基因美科技有限公司。
1.2.3 实时荧光定量PCR法检测DNMT1表达 清晨空腹状态下抽取静脉血4 mL后加入3.8%的枸橼酸钠抗凝，通过Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，置于-80℃保存待用。采用Trizol试剂提取的外周血单个核细胞中总RNA，将总RNA反转录为cDNA。PCR总反应体系（20μL）：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL和SYBR Premix 10μL，双蒸水6μL。引物合成由上海赛百盛公司完成。DNMT1引物：上 游 5′-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3′，下 游 5′-CCCCAGTCAAACTACCCACC-3′；
内参β-actin：上游5′-GT⁃GGGGCGCCCAGGCACCT-3′，下游5′-CTTCCTTAATGTCAC⁃GCACGATTG-3′。采用2-ΔΔCt法计算DNMT1的相对表达量。
1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。正态分布计量资料用表示，2组间均数比较采用两独立样本t检验。采用Pearson相关分析。多因素Logistic回归分析影响DKD发生的危险因素并建立24 h UAER、IL-6、DNMT1联合诊断评估模型。受试者工作特征（ROC）曲线分析24 h UAER、IL-6、DNMT1及三者联合检测在DKD中的诊断价值，利用R软件包3.6.3版本比较各指标曲线下面积（AUC），比较采用DeLong′s test检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 2组实验室指标比较 与对照组比较，DKD组空腹血糖、IL-6、DNMT1、血肌酐、24 h UAER、LDLC、糖化血红蛋白水平升高，而eGFR、HDL-C水平降低（均P＜0.05），2组的总胆固醇、三酰甘油差异无统计学意义，见表2。
Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD组和对照组实验室指标比较
Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD组和对照组实验室指标比较
＊＊P＜0.01；
eGFR单位为mL/（min·1.73 m2）。
组别对照组DKD组t n 50 150空腹血糖（mmol/L）4.91±0.52 10.80±2.30 17.928＊＊IL-6（μg/L）52.23±3.17 70.05±4.01 28.571＊＊DNMT1 0.07±0.02 0.13±0.03 13.188＊＊血肌酐（μmol/L）62.14±10.55 91.74±22.98 8.793＊＊eGFR 104.89±14.62 80.17±10.82 12.749＊＊24 h UAER（mg）5.12±1.62 604.29±107.63 39.297＊＊总胆固醇（mmol/L）4.68±0.82 4.42±0.93 1.761三酰甘油（mmol/L）1.83±0.62 2.01±0.83 1.407 HDL-C（mmol/L）1.42±0.24 1.19±0.23 6.057＊＊LDL-C（mmol/L）2.41±0.75 3.61±0.86 8.180＊＊糖化血红蛋白（%）0.67±0.08 9.08±1.12 52.963＊＊
2.2 DKD患者IL-6、DNMT1与其他临床指标的相关性 DKD组患者IL-6与DNMT1呈正相关（r=0.560，P＜0.05）。IL-6、DNMT1与24 h UAER呈正相关（均P＜0.05），与空腹血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、eGFR、HDL-C、LDL-C均无相关性（均P＞0.05），见表3。
Tab.3 Correlation of IL-6,DNMT1 and clinical indicators in DKD patients表3 DKD患者IL-6、DNMT1与临床指标的相关性
2.3 DKD影响因素分析 以是否发生DKD为因变量（是=1，否=0），以eGFR、24 h UAER、IL-6及DNMT1为自变量，Logistic回归分析结果显示，较高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影响DKD发生的独立危险因素（P＜0.05），见表4。
Tab.4 Analysis of influencing factors of DKD表4 DKD影响因素分析
2.4 24 h UAER、IL-6、DNMT1对DKD的诊断价值 24 h UAER、IL-6、DNMT1联合检测诊断DKD的 方 程 为：Log［P/（1-P）］=-1.867+0.258×（24 h UAER）+0.298×（IL-6）+0.776×（DNMT1）。联合检测诊断DKD的AUC高于24 h UAER、IL-6、DNMT1单一指标检测（Z分别为4.429、4.327、1.879，均P＜0.01），见表5、图1。
Tab.5 Diagnostic value of 24 h UAER,IL-6 and DNMT1 in diagnosing DKD表5 24 h UAER、IL-6、DNMT1对诊断DKD的诊断价值
Fig.1 ROC curve analysis of 24 h UAER,IL-6,DNMT1 and combined detection in the diagnosis of DKD图1 24 h UAER、IL-6、DNMT1及联合检测诊断DKD的ROC曲线分析
DKD是终末期肾病最常见的原因，易合并心力衰竭、脑卒中等心脑血管疾病，甚至导致患者死亡，严重威胁患者生命健康［7-8］。DKD的病因及发病机制较为复杂，多认为与高血糖引起的氧化应激损伤及炎症反应有关，活性氧及晚期糖基化产物能够激活系膜细胞中炎症反应，导致肾小球系膜增生和肾小球间质的纤维化，最终导致DKD的发生［9］。目前，临床上DKD的诊断主要依赖24 h UAER，但24 h UAER的测定受到感染、发热及心力衰竭等多种因素的影响，在DKD诊断和预测DKD疾病进展上仍存在一定的局限性。因此，寻找能够有效诊断DKD的血清标志物，对于延缓终末期肾病的发生具有重要的临床意义。
IL-6为白细胞介素家族中的促炎细胞因子，大多由单核细胞、巨噬细胞分泌，成纤维细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞也可分泌少量IL-6。本研究中，DKD患者血清IL-6水平明显升高，提示IL-6可能参与DKD的发病过程。有研究显示，肾足细胞表达IL-6受体gp130，当肾足细胞受脂多糖、高血糖损伤刺激时，能够促进IL-6的分泌［10］。24 h UAER是临床常用的诊断DKD的指标，24 h UAER升高通常能够增加DKD患者心血管事件和死亡风险。本研究中DKD患者IL-6的表达与24 h UAER呈正相关，证实了IL-6的表达升高可能参与DKD的发展。有研究发现，IL-6能够通过促进肾足细胞中Jacus相关激酶2结合gp130并发生自身磷酸化，进而诱导信号转导与转录活化因子3的磷酸化激活，促进足细胞肥大及凋亡，促进DKD的进展［11］。本研究中，多因素Logistic回归分析结果证实，IL-6升高是影响DKD发生的独立危险因素，提示IL-6升高是参与DKD疾病发生、发展的重要血清标志物。推测其机制，IL-6作为一种促炎细胞因子，可以招募并激活中性粒细胞、单核细胞以及巨噬细胞，促进肿瘤坏死因子α等促炎细胞因子的大量释放，导致单核细胞以及巨噬细胞对肾小球基底膜组织的浸润，进而使机体的炎症损伤加重，氧化应激代谢发生异常，加重了肾小球基底膜损伤［12］。
表观遗传学是核苷酸序列的甲基化、乙酰化等修饰引起基因表达的变化，从而参与机体炎症、代谢等生理及病理学过程的调控，与糖尿病的发生、发展关系密切［13］。岳锐等［14］研究认为，DNA甲基化可以通过影响细胞凋亡与代谢过程，从而对肾病患者的肾功能以及肾脏纤维化产生不利影响。DNMT1是负责维持DNA复制后甲基化模式的主要酶，可将甲基转移到基因组DNA的胞嘧啶核苷酸上，该基因的表达失常与小脑共济失调、肿瘤发生和发展密切相关［4］。本研究结果显示，DKD患者外周血单个核细胞中DNMT1表达明显升高，并且其表达水平与24 h UAER呈正相关，提示DNMT1表达升高参与DKD的疾病发生、发展过程。Zhang等［15］研究显示，DKD小鼠模型肾小球足细胞的DNMT1蛋白呈高表达，表明DNMT1促进了糖尿病肾病足细胞的炎症性损伤，而在使用DNA甲基化抑制剂5-Aza后蛋白尿的水平明显降低，足细胞损伤程度也有所减轻。本研究进一步证实，DNMT1升高是影响DKD发生的独立危险因素。Chen等［16］研究发现，糖尿病患者外周血单核细胞中DNMT1的上调能够诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白启动子区域胞嘧啶异常甲基化，引起哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路的过度激活，进而加重糖尿病肾脏组织的过度炎症。本研究中DNMT1与IL-6表达呈显著正相关，提示DNMT1与IL-6的表达可能存在相互作用的关系。分析其机制，一方面，IL-6能够直接激活DNMT1的表达，进而抑制下游E-钙黏蛋白的表达，促进细胞间质化，加重肾脏纤维化［17］；
另一方面，DNMT1的表达升高能够抑制IL-6的甲基化水平，促进IL-6的表达，参与DKD疾病的发生、发展过程［18］。本研究通过ROC分析发现，24 h UAER、DNMT1与IL-6联合检测诊断DKD的AUC显著高于各单一指标检测，提示三者联合检测是诊断DKD的良好指标，可作为后续临床诊断的可行参考。
综上所述，IL-6、DNMT1在DKD患者中表达上调，与DKD患者的病情发展情况密切相关。较高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影响DKD发生的独立危险因素，24 h UAER、DNMT1、IL-6联合检测可作为DKD临床诊断的预测指标。然而，本研究纳入的样本量相对较少，未对可能参与DKD患者病情发展的其他炎症因子如肿瘤坏死因子α、IL-1β等进行研究，有待今后进一步扩大样本量，并对其他可能参与DKD疾病发生、发展的其他炎症因子进行探索。
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