陈 杰， 何洛迪， 魏 杰， 赵 文， 马悦欣， 王 宇， 张 湾， 尹东鹏
(大连海洋大学 辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁 大连 116023)
综合养殖是利用生物不同的营养生态位，使养殖系统中的营养物质多次反复利用而提高其利用率的一种养殖模式[1]，也称生态养殖。近年来，主养“海蜇-缢蛏”的生态养殖模式在辽东地区得到了推广和普及，如辽宁省东港市2019年海水池塘养殖面积约0.67×104hm2，其中池塘立体养殖面积超0.47×104hm2，产值过亿元[2]。目前，对该模式生态养殖研究主要围绕食物网关系[3-4]、生源要素即碳、氮和磷[5]、悬浮颗粒物和有机碳[6]等方面展开，对细菌群落的研究鲜有报道。细菌群落可以反映养殖环境的健康状况，并参与生态系统的物质循环和能量流动[7]。同时养殖生物也受到细菌群落的影响，如某些有益菌可参与水质调控，将氨、亚硝酸盐和硫化氢这类有毒物质转化为低毒或无毒结构，以利于养殖生物生存与生长[8]；
此外，某些致病菌在达到其适宜生长条件时会呈爆发性增长导致养殖生物疾病发生[9]。因此，研究养殖池塘中细菌群落特征，能更好地监测养殖环境和防控养殖生物发生疾病。有关养殖池塘细菌群落多样性的研究多集中于传统养殖模式，如暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)[10]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[11]，南美白对虾(Litopenaeusvannamei)[12]，凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[13]等单一生物养殖池塘的细菌群落多样性，而对生态养殖池塘的报道较少[14-16]。本研究采用16S rDNA高通量测序技术，研究“海蜇-缢蛏”生态养殖池塘水体与沉积物中细菌群落结构特征及其主要环境驱动因子，旨在为海水生态养殖模式微生态环境调控提供参考。
1.1 材料
1.1.1 综合养殖池塘概况 试验养殖池塘位于辽宁省东港市北井子镇(39°84′99″N；
123°82′89″E)，池塘面积120 hm2，平均水深1.99 m。以海蜇和缢蛏为主要养殖种类，4月投放体长3～5 cm蛏子苗45筐，20～30万粒/筐，投放1 cm左右虾苗70万尾；
5月放3～5 cm规格海蜇苗90万尾和7～8 cm规格牙鲆鱼苗10万尾。投喂饵料为碎末玉筋鱼、沙蚕和人工配合饲料。
1.1.2 主要试剂与仪器设备 钼酸铵(天津市化工三厂有限公司)，氯化铵、硫酸铵、硫酸锰和EDTA二钠(天津市致远化学试剂有限公司)。便携式多参数水质分析仪(HQ30d，美国Hach公司)；
采水装置为水生80型采水器；
采泥装置为蚌斗式采泥器；
抽滤所需设备及用具为循环水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，河南省予华仪器有限公司)；
玻璃过滤器(T-50，天津市津腾实验设备有限公司)；
微孔滤膜(孔径0.2 μm，直径25 mm，上海兴亚净化材料厂)。
1.2 方法
1.2.1 样品采集及处理 为了全面掌握细菌群落的动态变化情况，2021年4月至8月对养殖池塘进行水样和沉积物样品采集，每月一次。每个池塘采用3点采样法，即进水口、中间和出水口三个位点。分别于每个位点表(水下0.5 m)、中、底(距底0.5 m)三层采水，由于池塘水深变化不大，采用混合采集方式，分层采水5 L混合，取500 mL混合水样装入已灭菌采样瓶中，依次命名为ZCW4、ZCW5、ZCW6、ZCW7、ZCW8；
同时每个位点采集池塘底部表层(5 cm内)沉积物，分别取5 mL混合泥样装入已灭菌EP管内。养殖周期内共采集样品30个。水样和沉积物于低温冰箱储存，尽快运回实验室处理。室内水样经0.22 μm微孔滤膜过滤，将过滤后的滤膜和沉积物分装于1.5 mL离心管中，经液氮处理5 min后于-80 ℃冰箱保存。
1.2.3 高通量测序及数据分析 水样和沉积物样品由北京诺禾致源生物公司进行高通量测序。采用CTAB法对样本基因组DNA进行提取，细菌16S rDNA基因V3～V4片段的扩增引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。下机数据进行拼接、过滤和质控后按照97%一致性进行OTUs聚类，再进行物种注释和分类。构建测序文库后在NovoMagic平台上进行多样性分析、UPGMA聚类分析和Spearman相关分析等。
2.1 养殖池塘细菌群落多样性
30个样品共得到平均有效序列657 428条，按照97%的相似性构建OTUs并获得注释信息的Tags数目平均为28 216个。水体中OTUs数目为786～2 141，平均为1 579个；
沉积物中OTUs数目为3 515～4 729，平均为4 045个。水体与沉积物中细菌分布花瓣图(图1)所示，水体中不同月份OTUs共享数目为288个，而沉积物中OTUs共享数目为2 035个。
图1 养殖池塘水体与沉积物中细菌分布花瓣图Fig.1 Distribution of bacteria in water and sediment of aquaculture pondA：水样，B：沉积物样品，数字4～8分别代表采样月份A：the water sample,B：the sediment sample, and the numbers 4-8 represent the sampling months respectively
利用Shannon指数和Simpson指数比较分析养殖池塘水体与沉积物中细菌多样性(表1)。结果表明，沉积物中细菌多样性指数均明显高于水体中细菌多样性，从时间上来看，5月水体与沉积物中细菌多样性指数均最高，而8月则最低。
表1 养殖池塘水体与沉积物中细菌多样性指数Table 1 Bacterial diversity index in water and sediment of aquaculture pond
物种注释养殖池塘共发现细菌112门、173纲、361目、526科、1 076属、494种，对OTUs丰富度前10的门水平物种相对丰度进行UPGMA聚类分析(图2)，结果表明，浮游细菌和沉积物细菌群落结构相似度低，各聚为一类。变形菌门、拟杆菌门和未分类的菌门为水体与沉积物中共有优势菌门。其中，水体中细菌优势门类主要为变形菌门46%、蓝细菌门16%、拟杆菌门11%、放线杆菌门8%和未分类的菌门7%；
沉积物中细菌优势门类主要为变形菌门22%、未分类的菌门16%、脱硫杆菌门14%、拟杆菌门12%、弯曲杆菌门6%、酸杆菌门(Acidobacteriota)4%和厚壁菌门2%。
图2 养殖池塘水与沉积物中细菌门水平上的物种相对丰度Fig.2 Relative abundance of species at the level of bacterial phylum in aquaculture pond water and sediment
水体中优势菌门变形菌门为α-变形菌，其包含的优势属分别为Planktomarina(4月为4.7%、5月为4.14%)、慢杆菌属(Lentibacter)(5月为7%、6月为8.55%)、HIMB11(6月为5.06%、7月为10.35%)、荔枝菌属(Litorimicrobium)(6月为7.7%、8月为3.29%)、海命菌属(Marivita)(4月为5.26%、5月为5.78%、6月为1.5%)、雷辛格氏菌属(Leisingera)(6月为1.83%、7月为7.22%、8月为3.33%)和CladeIa(4月为9.36%、5月为9.15%、6月为9.4%、7月为3.22%和8月为6.99%)，以上除CladeIa外均为红细菌目(Rhodobacterales)。沉积物中变形菌门为γ-变形菌，其包含的优势菌群分别为伍斯菌属(Woeseia)(4月为4.26%、5月为6.16%、6月为3.15%、7月为1.36%和8月为3.93%)、弧菌属(Vibrio)(4月为1.88%)、丽弧菌属(Aliivibrio)(4月为1.87%)、假单胞菌属(Pseudomonadaceae)(7月为5.36%)和MND1(6月为2.23%)。
2.2 细菌群落与环境因子的相关性
用Spearman相关研究环境因子与门水平菌群间相互关系，得到两两之间的相关性和显著性(图3)。在OTUs丰富度前10的菌群门类中，变形菌门、蓝细菌门和放线杆菌门与TN呈显著正相关(P<0.05)，与TP呈显著负相关(P<0.05)；
未分类菌门与TN呈极显著负相关(P<0.01)，与TP呈极显著正相关(P<0.01)；
弯曲杆菌门与TN呈显著负相关(P<0.05)，与TP呈显著正相关(P<0.05)；
脱硫杆菌门与TN呈显著负相关(P<0.05)，厚壁菌门与TP呈显著正相关(P<0.05)，其他门类与环境因子相关性不明显。
图3 养殖池塘细菌门水平Spearman相关性分析Fig.3 Spearman correlation analysis of bacterial phyla level in aquaculture pond纵向为环境因子，横向为菌群门类，中间热图对应的值为Spearman相关系数，介于-1～1之间，r>0为正相关，r<0为负相关，*表示有显著性差异(P<0.05)，**表示极显著差异(P<0.01)The vertical is environmental factors, the horizontal is flora, and the corresponding value of the intermediate heat map is Spearman correlation coefficient, which is between - 1-1,r>0 is positive correlation, r<0 is negative correlation, * indicates significant difference (P<0.05), * * indicates very significant difference (P<0.01)
本研究池塘沉积物主要采集表层底泥，其微生物与水体中环境因子相互作用密切相关，基于此，本研究比较分析了在同一水环境下水中与沉积物中细菌群落结构的差异。通过16S rDNA高通量测序结果表明，“海蜇-缢蛏”生态养殖池塘沉积物中细菌多样性指数明显高于水体中浮游细菌多样性，这与现有研究报道相一致[18-19]。分析原因，主要由于养殖池塘中动物粪便、饵料残渣和代谢物质等多富集于沉积物中[20]，给细菌提供了丰富的营养物质和适宜的环境条件，使其大量生长繁殖。
变形菌门和拟杆菌门是水体与沉积物共有优势菌群，变形菌门普遍存在于海洋环境中，且在数量上占有绝对优势。这可能是一方面基于现代分子序列数据分析，原核生物中变形菌的规模和数量是最大和最多的分支[21]；
另一方面由于养殖环境中氮磷浓度较高，而变形菌具有脱氮除磷的功能，参与水质调控，维持养殖生态系统的结构与功能[22-24]。本研究结果表明，水体中变形菌的主要类群为α-变形菌纲红细菌目，此类细菌是一类紫色非硫细菌，通过自身的光合色素(叶绿素a和类胡萝卜素)，利用硫化氢、硫代硫酸钠和分子氢进行光合自养，也能用不同基质做碳源进行异养光合代谢[25]。γ-变形菌为沉积物中变形菌的主要类群，其能利用不同类型和浓度的碳源，参与厌氧氨氧化过程[25]。因此，变形菌在养殖生态系统碳循环过程中扮演着重要角色。拟杆菌门为水体和沉积物中共有的第二大优势菌门，能分解有机物和参与碳循环[26]，拟杆菌门中黄杆菌(Flavobacteria)为优势菌群，除对养殖环境有积极影响外，也可能造成威胁，在高氨氮低溶氧条件下可使鱼类诱发疾病[27]。水中蓝细菌门未鉴定的Chloroplast菌群丰度也位居前列，在中国明对虾研究中也有报道[28]，译为“叶绿体”，因此推测其可参与光合作用。沉积物中弯曲杆菌门主要为硫卵菌(Sulfurovum)，这是一类硫氧化化能细菌，在有机物高度富集的海洋沉积物的硫、氮和氢循环中起关键作用[12]。此外，值得注意的是沉积物中脱硫杆菌门也占有较大优势，且出现于整个养殖周期。它是一种严格厌氧硫化细菌，在缺氧条件下转化硫化氢，对环境和养殖生物造成威胁[29]。
生物与环境相互作用，共同维持生态系统的结构与功能。研究表明，化学需氧量和有机碳是影响夏季仿刺参养殖池塘水体细菌群落构成的主导环境因子[13]，pH、温度和溶氧量是影响中华绒螯蟹养殖池塘水体菌群结构与功能的主要环境因子[30]，斑点叉尾鮰养殖池塘沉积物菌群结构与透明度和溶解性悬浮物显著相关[27]。氮和磷是生物生长所需的主要两类元素[31]，且海洋浮游细菌对氮磷的需求高[32]。本研究结果也表明，水体中优势菌群变形菌、蓝细菌和放线杆菌与总氮呈显著正相关，与总磷呈显著负相关；
沉积物中优势菌群为未分类的菌门、脱硫杆菌和弯曲杆菌与总氮呈显著负相关，与总磷呈显著正相关。由此可看出，总氮和总磷是影响“海蜇-缢蛏”养殖池塘细菌群落结构特征的主要环境驱动因子。然而，这些菌群与氮、磷如何相互作用还需进一步深入探究。