侯嘉欣 彭龙漩 杨得民 吕敏
摘要：近年来，新型纳米抗菌材料因其特殊的理化性质和作用机制，在抗菌膜方面展示了不容忽视的潜力.但是，如何提高这些抗菌剂穿透菌膜胞外聚合物基质（EPS ）的能力，以达到低剂量、高疗效的目的，仍是一个挑战.为了解决这个难题，通过一锅法成功合成了一种带正电、靶向菌膜中胞外脱氧核糖核酸（eDNA ）的沸石咪唑框架纳米复合颗粒（ZIF-8@D）.研究发现， ZIF-8@D 能够迅速穿透菌膜，并在菌膜内部释放脱氧核糖核酸酶 I （ DNase I ），DNase I 能水解菌膜中的 eDNA，以达到分散菌膜的目的.这项研究不仅为设计高穿透性的抗菌膜材料提供了新思路，而且拓展了沸石咪唑框架结构在生物医学领域的应用.
关键词：细菌耐药性；
沸石咪唑框架；
铜绿假单胞菌；
菌膜
中图分类号：Q 939 文献标志码：A 文章编号：1000-5137（2023）01-0053-07
Study on zeolitic imidazolate framework nanocomposites for biofilm eradication
HOU Jiaxin，PENG Longxuan，YANG Demin，LYU Min*
（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）
Abstract：In recent years，novel antibacterial nanomaterials show a non-negligible potential in anti-biofilm due to their specific physiochemical properties and mechanism of action. However，it is still a challenge to improve the ability of these antibacterial agents to penetrate the extracellular polymeric matrix（ EPS ） of the biofilm to achieve the goal of high efficacy at low dose . To solve this problem，we adopted the one-pot method to successfully synthesize a zeolitic imidazolate framework nanocomposite with positive charge and targeting extracellular deoxyribonucleic acid（ eDNA ） in the biofilm（ZIF-8@D）. The results showed that ZIF-8@D nanoparticles could quickly penetrate the biofilm and release deoxyribonuclease（ DNase I ） inside the biofilm，which hydrolyzed the eDNA to disperse the biofilm. This work not only provides a new insight into designing anti-biofilm materials with high penetrability，and also expands the application of zeolite imidazole frameworks in biomedicine .
Key words：antimicrobial resistance；
zeolitic imidazolate framework；
Pseudomonas aeruginosa；
biofilm
0 前言
專家预测到2050年，全球每年将有1000万人死于细菌耐药性.除了抗生素滥用导致细菌产生耐药基因外，细菌自身形成群体结构菌膜（biofilm）也是诱发细菌耐药性的重要因素[1-2].研究表明，60%～70%的细菌感染与菌膜的形成有关，而菌膜诱发的细菌耐药性与其自身结构密切相关[3-4].菌膜是一种有别于浮游细菌的生存方式，它是细菌为适应生存环境而吸附于材料表面，形成由细菌及其自身分泌的胞外聚合物基质（EPS ）组成的群体结构[5].EPS 是由胞外脱氧核糖核酸（eDNA ）、结构蛋白、胞外多糖和脂质等生物大分子通过缠结、静电吸附等方式形成的类水凝胶结构[6].eDNA 在细菌的黏附和菌膜的形成中起关键作用，成为当前菌膜清除的重要靶点[7].大量报道证实，菌膜结构可以有效阻碍环境不利因素（例如抗生素、机械力和渗透压等）对其内部细菌的直接伤害.临床处理菌膜细菌所需的抗生素剂量是处理浮游细菌的10～1000倍[8-10].因此，如何提高抗菌剂穿透菌膜 EPS 结构的能力，精准靶向菌膜结构组分，实现高效解决细菌菌膜感染，成为生物医学和材料学交叉研究领域的前沿热点.
近年来，金属有机框架材料（MOF ）因其可控的粒径、高比表面积、可调的孔径和良好的生物相容性，在药物递送、生物成像和疾病治疗等方面表现出极大的应用前景[11-14].沸石咪唑框架（ZIF-8）因具有多孔、高负载、低毒性，以及对 pH 敏感等特点，常作为药物和生物大分子（蛋白质、DNA 和酶等）的载体[15]，用于肿瘤和细菌感染等疾病的治疗.例如，BAGCHI 等[16]利用药物方酸（SQ）修饰的金属有机框架 ZIF-8，增强光动力（PDT ）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA ）和菌膜的疗效；
SU 等[17]开发了一种内置伏立康唑的沸石咪唑框架（V-ZIF ），锌离子（Zn2+）与伏立康唑的配位结合可减少伏立康唑的意外泄漏，实现了伏立康唑的零级释放动力学，有助于穿透白色念珠菌菌膜，并杀死念珠菌.目前，ZIF-8在抗菌膜方面的应用主要聚焦于运载抗生素进入菌膜，通过杀死细菌破坏菌膜.然而，精准靶向菌膜结构组分，通过物理或化学方法破坏生物大分子间的相互作用以实现菌膜清除的报道还较为少见.
因此，本研究选择革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1）为模式生物构建菌膜，以菌膜中的 eDNA为靶点构建新型抗菌膜策略.铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，可感染人体的任何组织和部位，引起手术切口和烧伤组织感染、中耳炎[18]、角膜炎[19]、尿道炎[20]、肺炎[21]和心内膜炎[22-23]等疾病，常被用于实验室研究菌膜行为的模式生物.本研究设计了一种新型抗菌膜材料，即用 ZIF-8纳米颗粒吸附脱氧核糖核酸酶 I（ DNase I ）形成沸石咪唑框架纳米复合颗粒 ZIF-8@D.该材料与菌膜间存在静电作用，能够增强材料在菌膜中的穿透性，菌膜内部酸性环境可以刺激 ZIF-8降解，释放 DNase I 和 Zn2+. DNase I 能水解 eDNA 以破坏菌膜结构和实现 Zn2+抗菌，实现高效清除菌膜的目的.本研究为深入了解菌膜与抗菌剂之间的相互作用提供了理论指导，也为治疗临床中的菌膜感染提供了新策略.
1 材料与方法
1.1 实验材料
DNase I （脱氧核糖核酸酶 I 来源于牛胰腺）、结晶紫（CV ）购于 Sigma-Aldrich 公司；
2-甲基咪唑、硝酸锌六水合物（Zn （ NO3）2·6H2 O ）购于上海国药集团化学试剂有限公司；
荧光染料 Alexa flour 647，SYTO 9购于 Invitrogen 公司；
LB肉汤培养基、Agar 琼脂粉购于生工生物工程（上海）股份有限公司；
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；
超纯水用Aquapro系统（电阻率为18 MΩ·cm）制备.
1.2 实验仪器
场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，Hitachi S-4800）；
动态光散射（DLS）分析仪（Malvern Nano-ZS90）；
紫外分光光度仪（Shimadzu UV-1800）；
荧光分光光度仪（Hitachi F-7000）；
酶标仪（ThermoMultiskan MK3）；
激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）；
pH计（MSC-100）；
离心机（Eppendorf Centrifuge 5424 R）；
超声机（XM300UHP）；
生化培养箱（LRH-70F）；
X 射线衍射仪（XRD，BRUKER/AXS，D8 ADVANCE）；
恒温振荡器（THZ-C-L ）.
1.3 实验方法
1.3.1 ZIF-8@D 的合成
2-甲基咪唑（0.28 g）充分溶解于1 mL 水中，Zn （ NO3）2·6H2O （0.015 g）充分溶解于100μL 水中；
两者充分混匀后，室温（25℃）静置2 h；
再向上述混合溶液中加入100μL DNase I 溶液（1.2 mg ·mL-1），充分混匀后室温（25℃）静置2 h；
10000 r ·min-1离心10 min 得到 ZIF-8@D.
1.3.2 ZIF-8@D 的表征
FE-SEM 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的形貌和粒径大小.DLS 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的 Zeta 电位；
在8 d 内测定 ZIF-8@D 水合粒径，确定材料的稳定性.XRD 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的晶体结构.
1.4 细菌培养
从4℃保存的细菌平板挑取单菌落接种于3 mL LB 液体培养基中，37℃摇床（220 r ·min-1）振荡培养过夜.收集菌悬液，10000 r ·min-1离心菌液1min，去除上清液，并用生理盐水（NaCl，质量分数为0.9%）重悬沉淀，用紫外分光光度计测定菌液在600 nm 处的光密度值（OD600），稀释菌液浓度至109 CFU ·mL-1备用.
1.5 ZIF-8@D 抗菌膜性能测定
1.5.1 菌膜生长
24孔板中加入浓度为107 CFU ·mL-1细菌悬液，37℃静态生长24h.培养结束后，轻轻吸去上部菌液，并用1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS ）轻轻清洗孔板底部的菌膜.然后，每孔加入200μL 的不同材料（DNase I， ZIF-8和 ZIF-8@D），37℃共同孵育2 h.
1.5.2 CV 染色
菌膜与 ZIF-8@D 共孵育2h 后，吸去上清液，用1 mL PBS 轻轻冲洗菌膜1次并风干.然后加入300μL 质量分数为0.1%的CV 染色，染色15 min，吸去上清，PBS 轻轻洗涤3次.用数码相机对菌膜进行拍照.最后，每孔加入1 mL 95%（质量分数）乙醇洗脱15 min，酶标仪测量细菌在595 nm 处的光密度值（OD595）.
1.5.3 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM ）成像
红色荧光染料 Alexa Fluor 647（10μmol·mL-1）与 ZIF-8@D 在300 r ·min-1振荡结合2 h，ZIF-8@D 被标记为红色.
培养24 h 的菌膜，吸去上清液后，用1 mL PBS 轻轻清洗1次，每孔加入300μL SYTO 9（20μmol·mL-1，绿色荧光，标记细菌）染色15 min.吸去上清，用 PBS 轻轻洗去残留的 SYTO 9，再将200μL Alexa Fluor 647标记过的 ZIF-8@D 加到每孔中，共孵育2h，吸去上清液，用1 mL PBS 轻轻冲洗菌膜1次.随后用 CLSM 成像观察.SYTO 9和 Alexa Fluor 647的激發光/发射光波长分别为480 nm/500 nm 和650 nm/666 nm.通过沿 Z 轴以0.1μm 间隔扫描菌膜获取3D 图像.
2 结果与讨论
2.1 ZIF-8@D 的合成及表征
首先，采用水相合成的方法制備 ZIF-8[24]，然后利用 ZIF-8的多孔和吸附能力，简单混合，将 DNase I 吸附到框架表面合成 ZIF-8@D，如图1所示.
用 FE-SEM 观察 ZIF-8和 ZIF-8@D 的形貌，如图2（a）～2（d）所示，合成的 ZIF-8和 ZIF-8@D 为多面体结构.粒径统计分析结果如图2（e）～2（f）所示，ZIF-8的尺寸约为（59.1±11.7） nm，ZIF-8@D 尺寸约为（64.6±10.0） nm. DNase I 的分子质量为32 ku，ZIF-8@D 直径的增大归因于 ZIF-8和 DNase I 的复合.
用 Zeta 电位分析测量 ZIF-8和 ZIF-8@D 的电势，2种样品电位分别为（37.4±0.7） mV和（36.2±4.2） mV，均带正电荷，有利于材料与带负电的菌膜相互作用.DNase I 的等电点为4.7，在中性溶液中带负电，其吸附于 ZIF-8表面时，并不会导致显著的电荷变化.用 XRD 分析 ZIF-8和 ZIF-8@D 的晶体结构，如图3所示，晶向指数符合文献报道的 ZIF-8晶型，说明在合成过程中材料的结晶度未受损[25].此外，如图4所示，该材料在8 d 时间内的水合粒径几乎没有变化，证明 ZIF-8@D 具有良好的水分散性和稳定性.
2.2 ZIF-8@D 对菌膜结构的清除效果
本研究致力于构建一种具有良好穿透力和高效清除菌膜的抗菌膜材料.根据铜绿假单胞菌 PAO1菌膜生长动力学，选取培养24 h 后的成熟菌膜作为研究对象.预实验结果显示共孵育2 h 的效果较为合适，且此后延长时间均无显著性差异，故将 ZIF-8@D 与成熟菌膜共孵育2 h，然后进行 CV 染色，分析菌膜生物量.如图5（a）所示，DNase I，ZIF-8和 ZIF-8@D 都能够破坏菌膜，破坏率分别为63.9%，69.3%和87.8%. DNase I 可以降解菌膜 eDNA，然后破坏菌膜的稳定性[26].ZIF-8对菌膜造成破坏可能缘于其释放的 Zn2+可以抗菌，细菌死亡导致菌膜结构分解[27].与 DNase I 和 ZIF-8相比，ZIF-8@D 对成熟菌膜的高破坏率表明，DNase I 和 ZIF-8复合后产生了协同抗菌膜效应.
图5（b）为用激光共聚焦显微技术分析的ZIF-8@D 材料在菌膜中的穿透和分布情况（红色荧光为 ZIF-8@D，绿色荧光为菌膜）.ZIF-8@D 穿透菌膜过程中，随机选取一个区域，进行正交剖面观察，携带红色荧光的 ZIF-8@D 嵌入绿色菌膜中，表明 ZIF-8@D 能够顺利穿透菌膜.从如图5（c）所示的菌膜3D 图中观察到黄色荧光，这说明 ZIF-8@D（红色荧光）和菌膜细菌（绿色荧光）相互作用，证明 ZIF-8@D 穿透了表面 EPS 结构自主进入菌膜内部.其中的菌膜内部黑色部分表示 ZIF-8@D 对菌膜进行了一定程度的破坏.对3D 荧光图进行量化后，红绿荧光的趋势随菌膜纵深保持一致，表明在菌膜不同深度的 ZIF-8@D 与菌膜嵌入结合的情况良好，如图5（d）所示.
综上，与其他复合材料所需的6 h 相比[28]，ZIF-8@D 能够在更短的时间内迅速穿透菌膜，并进入菌膜内部，而其吸附的 DNase I 能够水解菌膜 eDNA，达到分散菌膜的目的.
2.3 ZIF-8@D 对菌膜的作用机制
结合 ZIF-8@D 的理化性质和对菌膜的作用效果，推测 ZIF-8@D 破坏成熟菌膜的机制包括以下几个阶段，如图6所示：首先，带负电的菌膜通过静电相互作用将带正电的 ZIF-8@D 运输穿透 EPS[29]；
同时， ZIF-8@D 的粒径小于菌膜类凝胶的形成孔径（500 nm），因此可以快速进入菌膜内部[30]；
接着，当ZIF-8@D 材料进入菌膜后，响应菌膜内部的酸性环境裂解框架，释放出 DNase I 和 Zn2+[27]；
最后，DNase I 特异性识别底物，即菌膜中的 eDNA，并进行水解 eDNA，进而瓦解 EPS 结构，达到分散菌膜的目的[26，31].
3 结论
抗菌剂难穿透细菌菌膜是阻碍其发挥高疗效的重要原因.本研究通过简单的一步合成法制备了稳定性和分散性良好的新型纳米复合颗粒 ZIF-8@D. ZIF-8@D 既保持了 DNase I 的催化活性，而且能够携带酶快速穿透菌膜.进入菌膜后，ZIF-8@D 可响应菌膜酸性环境，释放 DNase I，水解 eDNA，分散菌膜，最终达到抗菌膜的功效.尽管 ZIF-8@D 可以在2 h 内穿透并清除大约90%菌膜，但是剩余10%的菌膜依然具有生长为体积更大菌膜的潜在风险和危害.因此，进一步提高 ZIF-8@D 分散能力和增强其杀死细菌能力是未来需要解决的问题.本研究不仅为清除菌膜提供了一种新型纳米材料，也为解决细菌耐药性问题提供了新思路.
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（責任编辑：郁慧，顾浩然）
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