佘小漫 李萍 蓝国兵 于琳 李正刚 汤亚飞 何自福
摘要 茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病，并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明，引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鉴定结果表明，分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌为1号生理小种和生化变种3。egl基因部分序列系统进化分析表明，15株假茄科雷尔氏菌分属4个序列变种，其中8株菌株为序列变种17，5株菌株为序列变种13，其余2株菌株分别为序列变种14和序列变种54。本文是我国首次报道假茄科雷尔氏菌侵染引起向日葵青枯病。
关键词 向日葵; 假茄科雷尔氏菌; 致病性; 分子鉴定; 序列变种
中图分类号：
S436.8
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2022031
Abstract Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum species complex （RSSC） is one of the devastating diseases in crop production， seriously reducing the yield of crop. In 2020， sunflower （Helianthus annuus） bacterial wilt was firstly observed in Dongguan city， Guangdong province， and the pathogen of sunflower bacterial wilt was identified. Kochs postulation test， 16S rDNA gene and phylotypes analysis indicated that the pathogen of sunflower bacterial wilt was Ralstonia pseudosolanacearum. Physiological and biochemical characteristics and pathogenicity analysis demonstrated that 15 isolates belong to race 1， biovar 3. Based on results of partial egl gene sequence analysis， 15 isolates were clustered into four egl-sequence type groups， eight of 15 isolates were sequevar 17， five of 15 isolates were sequevar 13， and the other two isolates were sequevar 14 and sequevar 54. This is the first record of sunflower bacterial wilt caused by R.pseudosolanacearum in China.
Key words sunflower; Ralstonia pseudosolanacearum; pathogenicity; molecular identification; sequevar
由茄科雷爾氏菌复合种Ralstonia solanacearum species complex（RSSC）侵染引起的作物青枯病是热带、亚热带和温带地区最重要、最具毁灭性的细菌性病害之一。茄科雷尔氏菌复合种的寄主范围广泛，可侵染54科的200多种植物［1］。对于该复合种，截至目前有多个种下分类方案，包括基于寄主范围的5个生理小种（race）［2-4］，基于对3种双糖和3种己醇的氧化利用情况的6个生化变种（biovar）［4-7］，根据分子系统进化分析的4个地理分支［8-14］，利用演化型特异性复合PCR分析的4个演化型以及根据菌株egl基因序列同源性分析的序列变种［15］。在上述分类方案中，演化型与地理分支两种分类结果基本一致，演化型Ⅰ和Ⅱ菌株分别对应亚洲来源菌株和美洲来源菌株，演化型Ⅲ包含来自非洲的菌株，演化型Ⅳ包含来自印度尼西亚的菌株以及茄科雷尔氏菌的近缘种蒲桃雷尔氏菌Ralstonia syzygii和引起香蕉血液病的BDB菌。2011年，Safni等［16］根据基因组分析结果建议将茄科雷尔氏菌复合种划分为3个种。此后，Prior等2016年结合茄科雷尔氏菌复合种菌株的表型、基因组比对和转录组分析结果，进一步将茄科雷尔氏菌复合种划分为3个种，即假茄科雷尔氏菌R.pseudosolanacearum （含演化型Ⅰ和演化型Ⅲ茄科雷尔氏菌）、茄科雷尔氏菌R.solanacearum（演化型Ⅱ茄科雷尔氏菌）和蒲桃雷尔氏菌R.syzygii（演化型Ⅳ茄科雷尔氏菌、R.syzygii和BDB菌一起构成）［17］。2020年，Etminani等利用茄科雷尔氏菌复合种57个看家基因系统发育分析进一步支持该分类方法［18］。
在我国，自20世纪30年代记录花生青枯病发生以来，除西藏外，其他30个省（市、自治区）均报道有作物青枯病，其中广东、广西、海南等南方省份是作物青枯病的高发区;在我国，茄科雷尔氏菌复合种寄主已达39科90余种植物，其中有20多种寄主植物在国外未见报道［19］。我国已报道的茄科雷尔氏菌复合种菌株分属演化型Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ［20-21］，即假茄科雷尔氏菌、茄科雷尔氏菌和蒲桃雷尔氏菌;存在1号、3号、4号和5号生理小种，5个生化变种，以及1、4、7、12、13、14、15、16、17、18、30、34、44、45、48、54、55、56、57、70和71等21个序列变种［21-26］。
广东地处热带、亚热带，常年高温、多雨，十分有利于作物青枯病的发生与流行，每年该病都会造成较大的损失。2020年5月，本研究团队在进行作物青枯病发生情况调查与监测时发现东莞市一观赏向日葵种植区部分向日葵植株发生了青枯病，其田间症状表现为整株萎蔫，初期病株顶部叶片萎蔫，随后下部叶片萎蔫，但叶片仍为绿色，茎基部皮层部分发黑;后期植株叶片干枯，剥开维管束呈褐色至黑色（图1）。截至目前，尚未见国内有向日葵青枯病发生的报道。为此，本研究对引起广东省东莞市向日葵青枯病的病原菌进行鉴定，为防控向日葵青枯病提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2020年5月，在广东省东莞市寮步镇公园发现部分观赏向日葵植株表现为典型的青枯病症状，随机采集15株向日葵青枯病植株，带回实验室检测与鉴定。
试验寄主植物包括向日葵、番茄（‘东茄）、茄子（‘白龙）、辣椒（‘粤红3号）、烟草（‘普通烟）、香蕉（‘大丰1号）和沙姜。
假茄科雷尔氏菌辣椒菌株GY-2（演化型Ⅰ、1号生理小种、生化变种3）和演化型Ⅱ菌株HZ-1为本实验室分离、鉴定与保存。
1.2 培养基
TZC培养基：蛋白胨10 g，酪朊水解物1 g，葡萄糖5 g，琼脂17 g，用ddH2O定容至1 000 mL，pH 7.2，121℃灭菌 20 min。灭菌后冷却至60℃左右加入已过滤灭菌的1% TZC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）水溶液，使其终浓度为0.005%。
碳水化合物利用基本培养基：磷酸二氢铵 1.0 g、氯化钾 0.2 g、七水硫酸镁 0.2 g、酵母提取物0.2 g、溴百里酚藍指示剂2 mL（1.6 %乙醇溶液），用ddH2O定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌 20 min。
1.3 病原菌的分离、纯化与保存
切取向日葵病株的茎基部或根茎部的变色维管束组织，在显微镜下检查。按佘小漫等［27］的方法从病组织中分离病原细菌，在TZC琼脂平板上分离与培养获得单菌落，获得15株纯化菌株（RS638～RS652），20℃恒温保存。
1.4 病原菌致病性测定
纯化菌株在TZC培养基上，30℃培养48 h，选取中间粉红色，周围乳白色的单菌落用于试验。采用菌液伤根接种法接种3～5叶期的健康向日葵、番茄、茄子、辣椒、烟草植株，每株菌株分别接种15株植物，接种菌液浓度为1×108 cfu/mL，浸根20 min，测定其致病性。采用注射法接种沙姜和香蕉茎基部，每株菌株分别接种15株植物，接种菌液浓度为3×108 cfu/mL，接种量500 μL。每种作物每处理设3次重复。接种试验期间网室内气温为28～36℃。以分离自辣椒的假茄科雷尔氏菌菌株GY-2为对照菌株。
采用Excel 2010和DPS 19.05软件对试验数据进行统计分析;采用单因素方差分析和Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验 （P＜0.05）;表中数据为平均值±标准误。
1.5 病原菌的鉴定
1.5.1 DNA 提取
菌株在TZC培养基平板上30℃培养48 h后，挑取菌落接种到TZC液体培养基，30℃培养过夜，取1.5 mL菌液12 000 g离心1 min，用EasyPure Genomic DNA Kit（全式金公司）细菌基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，作为PCR扩增模板。
1.5.2 16S rDNA序列分析
以通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1541r（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）［28］进行PCR扩增并测序。PCR扩增采用50 μL 反应体系， 其中Premix ExTaq-25 μL，模板50 ng，引物27f和1541r各6 pmol。反应程序为96℃预变性5 min；
94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 3 min，35 个循环;72℃ 延伸10 min。将测序所得到的核苷酸序列在GenBank中进行BLAST序列比对分析。
1.5.3 演化型鉴定
参照Fegan等［15］的方法测定上述15株菌株的演化型，分别以Nmult：21：1F（5′-CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3′，演化型Ⅰ）、Nmult：21：2F（5′-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3′，演化型Ⅱ）、Nmult：22：InF（5′-ATTGCCAAGACGAGAGAA-GTA-3′，演化型Ⅲ）、Nmult：23：AF（5′-ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT-3′，演化型Ⅳ）、Nmult：22：RR（5′-TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3′），以及茄科雷尔氏菌复合种特异性引物759f（5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′）和760r（5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′）进行复合PCR扩增。25 μL PCR扩增体系，其中Premix ExTaq 12.5 μL，模板30 ng，引物Nmult：21：1F、Nmult：21：2F和Nmult：22：InF 各3 pmol，Nmult：
23：
AF和Nmult：
22：
RR各9 pmol，759f/760r 各2 pmol。反应程序为96℃预变性5 min；
94℃ 15 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环;72℃ 延伸10 min。2.5% 琼脂糖凝胶中电泳检测PCR 产物，根据带型确定供试菌株的分类地位。
1.5.4 序列变种鉴定
以eglF（5′-TCTCCATTTTTCCATTTCGTCATG-3′）和eglR（5′-ATGCCATCCGCCACGGACCCGGC-3′）为引物，PCR扩增茄科雷尔氏菌内葡聚糖（egl）基因序列。PCR扩增采用50 μL 反应体系， 其中Premix ExTaq 25 μL，模板50 ng，引物eglF和eglR各8 pmol，二甲亚砜2 μL。反应程序为96℃预变性9 min；
94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 2.5 min，35 个循环;72℃ 延伸10 min。将PCR扩增产物进行序列测定。应用MEGA-X 软件对egl基因序列进行系统进化分析，确定菌株的序列变种。
1.5.5 生化变种测定
按方中达［29］的方法进行。将乳糖、麦芽糖、D （+）-纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、卫茅醇分别配制成10%溶液，过滤灭菌后加入基本培养基至终浓度1.0%，3次重复。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离及培养性状
显微镜下可见向日葵病组织维管束的切口处有大量细菌喷出。在TZC培养基平板上，30℃培养48 h后，分离自向日葵病株的菌株在TZC培养基平板上产生了茄科雷尔氏菌的典型菌落形态，近圆形或梭形，隆起，中间粉红色，周围乳白色。
2.2 病原菌致病性测定
将纯化的5株代表菌株分别回接3～5叶期健康的向日葵植株。接种后3 d，植株即陆续开始表现萎蔫症状。随着时间的推移，病株症状逐渐加重，7 d 后完全萎蔫枯死，与田间向日葵青枯病株的症状表现一致（图1）。从接种的病株中均可分离到与接种用病原菌相同的菌株。这些结果表明，分离获得的细菌即是引起向日葵青枯病的病原菌。对照菌株GY-2对向日葵的致病力较低（表1）。
室内伤根或注射接种6种寄主植物结果显示（表1），15株菌株均可侵染番茄、茄子、辣椒，部分菌株可侵染沙姜和烟草，病株率分别为93.33%～100%、13.33%～60.00%、46.67%～100%、0～33.33%和0～86.67%，15株菌株均不能侵染香蕉;对照菌株GY-2侵染番茄、茄子、辣椒、烟草，不侵染沙姜和香蕉（表1）。根据茄科雷尔氏菌复合种生理小种划分标准［2-4］，向日葵青枯病病原菌应属1号生理小种。
2.3 病原菌的鉴定
2.3.1 16S rDNA序列分析
PCR扩增获得15株病原菌的 16S rDNA的近全长序列，均为1 432 bp（GenBank登录号：MZ676084～MZ676098），序列间一致性为100%。BLAST比对结果表明，15个序列与Ralstonia solanacearum FJAT1303.F1 16S rDNA（GenBank登录号：CP052128）的一致性为100%。
2.3.2 演化型鉴定
采用复合PCR 检测体系对15株病原菌进行检测，结果表明：15株菌株均可同时扩增得到144 bp的茄科雷尔氏菌复合种演化型Ⅰ特异性条带和280 bp的特异性条带（图2）。因此，引起向日葵青枯病的15株菌株均属茄科雷尔氏菌复合种演化型 I菌株，即假茄科雷尔氏菌。
2.3.3 序列变种鉴定
序列测定结果表明，15株菌株的egl基因部分序列长为698～699 bp，egl基因序列间一致性为99%～100%。利用MEGA X软件，将15株菌株与GenBank中48株茄科雷尔氏菌复合种菌株的egl基因序列进行系统进化分析，结果（图3）显示，分离自向日葵的15株菌株均为茄科雷尔氏菌复合种演化型Ⅰ，与演化型鉴定结果一致，即假茄科雷尔氏菌。15株假茄科雷尔氏菌菌株分属4个序列变种，其中RS641、RS642、RS644、RS645、RS646、RS648、RS649和RS652等8株菌株为序列变种17，RS638、RS640、RS643、RS650和RS651等5株菌株为序列变种13，RS647和RS639分別为序列变种14和序列变种54（图3）。
2.3.4 生化变种测定结果
碳水化合物利用试验结果表明，分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌菌株与对照菌株GY-2一致，都可以利用麦芽糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇和卫矛醇等6种碳水化合物。根据茄科雷尔氏菌复合种生化变种划分标准［4-7］，引起向日葵青枯病的假茄科雷尔氏菌属于生化变种3。
3 结论与讨论
本文对发生在广东省东莞市的向日葵青枯病病原菌进行了鉴定。通过对病原菌菌落形态特征、人工接种试验，以及16S rRNA基因序列、生理生化特性和egl基因序列比较分析，明确了引起广东省东莞市向日葵青枯病的病原菌为雷尔氏菌属假茄科雷尔氏菌，1号生理小种、生化变种3，并且存在序列变种13、14、17和54。
广东省是我国最早记录作物青枯病发生的省份，也是我国作物青枯病发生最为严重的省份之一。本研究团队自1999年以来持续对广东省作物青枯病发生情况进行监测，不断发现作物青枯病的新寄主，如空心菜［30］、沙姜［31］、胜红蓟［27］、南瓜等［26］，2020年又发现向日葵青枯病。Ramesh等曾报道印度发生向日葵青枯病，分离自向日葵的菌株RS-09-190为茄科雷尔氏菌复合种演化型Ⅰ菌株，即假茄科雷尔氏菌，生化变种3，其生理小种和序列变种分类情况并未明确［32］。本研究对发生在我国的向日葵青枯病病原菌进行了鉴定，为向日葵青枯病的防控提供科学依据，也为分析我国假茄科雷尔氏菌分布及种群进化等研究提供了菌株材料。
假茄科雷尔氏菌进化变异较快，菌系分化明显，明确其种内遗传多样性对探索作物青枯病防控策略具有指导意义。生理生化测定结果表明，本研究从向日葵上分离到的假茄科雷尔氏菌均为生化变种3，未发现生化变种1、2、4和5的菌株，研究结果与曾宪铭等［33］和She等［22］的结果一致。演化型鉴定结果表明，15株菌株均为假茄科雷尔氏菌，即茄科雷尔氏菌复合种演化型I，该结果与Fegan等认为的亚洲起源的菌株属于茄科雷尔氏菌复合种演化型I（生化变种3、4和5）分类框架一致［15］。
目前，國际上报道的假茄科雷尔氏菌有36个序列变种［34-35］，我国存在12、13、14、15、16、17、18、30、34、44、45、48、54、55、56、57、70和71等18个序列变种 ［21-26］，而广东省已报道有序列变种13、14、15、17、18、34、44、45、48、56和57［22，26］。本研究egl基因系统进化分析结果表明，15株假茄科雷尔氏菌菌株存在4个序列变种，分别为13、14、17和54。序列变种54是首次在广东发现，此前序列变种54的菌株分布在广西、贵州、安徽、湖北和重庆等地［23-24］。分离自相同寄主而序列变种不同的菌株的致病力有差异［22，24］，本研究的15株假茄科雷尔氏菌菌株分属4个序列变种，只有序列变种54的菌株RS639对普通烟草有较强的致病力，序列变种13的菌株RS638和RS650、序列变种54菌株RS639以及序列变种17的菌株RS642可侵染沙姜，但致病力较弱。不同序列变种菌株间致病力差异的机理还有待进一步研究。
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（責任编辑：田 喆）
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