张雨琪，丁明珠，吴金凤，郑海香，张 磊，王 星
雄激素受体(androgen receptor，AR)属Ⅰ型类固醇类激素受体，主要与雄激素特异性结合后对生殖及非生殖系统行使重要生理功能。AR由4个结构域组成，为N端转录激活区(N-terminal domain，NTD)、高度保守的DNA结合区(DNA-binding domain)、铰链区(hinge)和配体结合区(ligand-binding domain, LBD)，分别行使AR转录激活、识别结合DNA、调节AR空间构象与高度特异结合雄激素等功能[1-2]。近年来，越来越多的肿瘤和病毒感染性疾病被发现与雄激素信号轴调控异常密切相关[3-5]，并对病毒有直接调控作用[6]。肆虐全球的新型冠状病毒感染同样表现出性别偏倚，男性患者的症状更严重，死亡率更高[7]。AR能以经典的转录因子角色促进肿瘤病毒的基因表达及致瘤，但此作用是否经由AR与病毒基因组的直接结合而发生目前未知，因此系统性构建AR全长及各功能域的GST融合蛋白，将为后续开展GST-pull down等直接相互作用研究及明确最小互作域等提供基础。
1.1 菌株、质粒及抗体大肠埃希菌感受态细胞DH5α、BL21(DE3)菌种(ZEC-0005-20、ZEC-0014-20)购自中国福州载基生物科技有限公司；
pGEX-4T-1质粒、AR-FL-pcDNA 3.1/Hygro质粒由福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室保存并提供；
α-AR抗体(货号：ab74272)购自美国Abcam公司，GST标签抗体、兔抗小鼠IgG抗体、小鼠抗兔IgG抗体(货号：2622、7074、5127)购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 主要试剂PrimeSTAR Max Premix (2×) DNA聚合酶(货号：R045A, Takara Bio Inc.)；
XhoI、BamH I、T4 DNA连接酶(货号：R0146L、R0136L、M0202L, New England Biolabs Inc.)；
考马斯亮蓝染色溶液(货号：C462151, Bio Basic Inc.)；
RIPA裂解液、溶菌酶(货号：ST206、P0013B，上海碧云天生物技术有限公司)；
谷胱甘肽还原型[货号：A600229，生工生物工程(上海)股份有限公司]；
IPTG(货号：80909-1.5，北京天恩泽基因科技有限公司)；
谷胱甘肽琼脂糖珠子(货号：17075601, 美国GE Healthcare公司)；
蛋白酶抑制剂(货号：HY-K0010, MedChemExpress LLC)。通用型DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒[货号：DP214-02、DP118-02，天根生化科技(北京)有限公司]；
BCA蛋白定量试剂盒(货号：23227, Thermo Fisher Scientific Inc.)。
1.3 基于pGEX-4T-1质粒构建AR全长及功能域截短体的重组质粒
1.3.1AR全长及截短目的基因的扩增和回收 根据pGEX-4T-1质粒骨架和AR基因序列选择BamH I与Xho I酶切位点，以本实验室保存的ARFL-pcDNA 3.1/Hygro质粒为模板，聚合酶链式(polymerase chain reaction，PCR)反应扩增并纯化回收AR全长及截短目的基因片段，上下游引物序列见表1。扩增参数为98 ℃预变性5 min；
98 ℃变性10 s，62 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，总共30个循环；
最后72 ℃延伸10 min。
表1 AR全长及截短目的基因引物的名称和序列
1.3.2重组质粒的构建与鉴定 用限制性内切酶BamH I与Xho I对质粒与目的基因片段在37 ℃中进行酶切5 h，酶切后两者以1 ∶5比例用T4连接酶16 ℃连接2 h以上。连接产物转化入BL21(DE3)感受态菌株中，以100 μg/ml氨苄青霉素(ampicillin，Amp)筛选抗性单克隆。以菌液为模板，上下游引物与扩增参数同1.3.1项，进行PCR扩增鉴定。进一步对PCR结果阳性的菌液进行质粒抽提，同上对质粒行BamH I与Xho I的双酶切鉴定，并将鉴定结果阳性的质粒送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。
1.4 AR全长及功能域截短体融合蛋白的诱导表达及条件优化取测序正确的菌液以4%接种于Amp LB培养液中，振荡培养菌体处于对数生长期(OD值为0.6～0.8)，留取1.5 ml菌液诱导前对照。设置不同IPTG浓度(0.1、0.5、1 mmol/L)，不同诱导温度(30、37 ℃)，并在不同时间点(6、12 h)收集1.5 ml诱导后菌液，离心得到细菌沉淀。用100 μl RIPA裂解液重悬细菌沉淀并冰上裂解10 min，冰浴超声破碎菌体，于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝中电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色胶块，分析各组间目的蛋白表达效率，选择最佳的诱导表达条件进行大量重组菌的诱导表达，并用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。
1.5 Western blot鉴定融合蛋白表达将诱导前菌液、诱导后菌液与纯化后蛋白上样于SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白300 mA、1.5 h转至PVDF膜上，于5%牛血清白蛋白中室温封闭1 h。将膜与AR和GST的特异性抗体(1 ∶1 000)于4 ℃过夜孵育结合，次日，用洗膜液(含0.1% Tween 20的1×TBST)快速转动洗膜3次，分别加入HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体、小鼠抗兔IgG抗体(1 ∶10 000)，室温孵育1 h。洗膜后均匀滴加ECL化学发光底物，置于ImageQuant LAS 4000凝胶成像仪中进行曝光。
1.6 凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)鉴定纯化蛋白功能将纯化后融合蛋白、GST(150 pmol)与一种能和AR结合的病毒荧光探针(荧光探针的设计及扩增同先前研究[6]，30 pmol)在EMSA结合缓冲液中混匀，25 ℃孵育30 min。配置20 ml 6.5%非变性PAGE胶：将1 ml 10×TBE、4.4 ml 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液、1 ml 50%甘油、20 μl TEMED、13.6 ml ddH2O均匀混合，室温静置10 min脱气，再加入120 μl 10%过硫酸胺吹打混匀，灌胶后室温放置2 h以上。在0.5×TBE电泳缓冲液中120 V冰上预电泳至电流稳定在15 mA左右。将孵育后的蛋白-DNA探针复合物小心上样于胶孔内，120 V冰上电泳2 h以上。用ODYSSEY CLx双色红外激光成像仪分析结果。
2.1 设计与扩增AR全长及各功能域截短体基因片段本文共设计了4个截短体AR，使其缺失或仅存在一个功能域(图1A)。依次为全长AR(AR-FL，1-919 aa)及缺失LBD(AR△LBD，1-669 aa)、缺失LBD与铰链区(仅余N端转录激活域与DNA结合域)(AR-NTD+DBD，1-625 aa)、缺失LBD、铰链区(Hinge)和DBD的N端转录激活域(AR-NTD，1-537 aa)、配体结合域(AR-LBD，669-919 aa)的截短体AR。PCR扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在标准分子量Marker相对应长度2 763、2 004、1 872、1 608、753 bp处，分别出现单一清晰的扩增条带，成功获得AR-FL、AR△LBD、AR-NTD+DBD、AR-NTD、AR-LBD目的基因片段(图1B)。
图1 设计和扩增AR全长和各功能域截短体基因片段
2.2 构建并鉴定AR全长及各功能域的原核表达质粒以菌液为模板进行PCR扩增检测，如图2A所示，在相应分子量大小处出现单一清晰的扩增条带。阳性质粒双酶切后出现两条泳带，靠近胶孔的条带为酶切后的pGEX-4T-1质粒，远离胶孔的则是酶切出的插入片段(图2B)。对双重鉴定中均显示阳性的克隆进行测序，将插入片段测序结果与NCBI GenBank标准株氨基酸序列(NG-009014.2)进行比对(图2C)，AR全长、AR-NTD+DBD、AR-LBD序列与标准株一致， AR-NTD的第460个氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸。最终成功构建4个重组质粒，分别为AR-FL-pGEX-4T-1、AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1、AR-LBD-pGEX-4T-1。
2.3 诱导表达各GST融合蛋白SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色分析重组菌在诱导后产生的可溶性蛋白，结果显示，与未加IPTG的阴性对照组相比，加入IPTG后可诱导空载、AR-FL-pGEX-4T-1、AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1、AR-LBD-pGEX-4T-1重组菌分别在26、129、96、86、54 ku处出现了非菌体蛋白的大量表达条带(图3，红色箭头指示处)。对比两个诱导时间，诱导12 h比6 h的蛋白条带总体染色更浓，但相应分子量处目的蛋白的表达条带差异不明显。对比两个诱导温度，细菌在30 ℃诱导时蛋白表达量略优于37 ℃，特别是GST蛋白明显在30 ℃条件下表达量更大。并且当IPTG终浓度为1 mmol/L时细菌蛋白总量有所下降，表现出一定的试剂毒性。因此，IPTG终浓度0.1 mmol/L、30 ℃、200 r/min诱导6 h为最佳诱导条件，在此条件下小量诱导的目的蛋白条带最明显。
图2 重组质粒的菌液PCR、双酶切鉴定及同源比对结果
2.4 Western blot与EMSA鉴定各融合蛋白表达及其功能Western blot检测了重组质粒诱导表达蛋白，结果显示(图4A)，AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1重组质粒诱导表达后的粗提总蛋白与纯化蛋白中均能检测出特异性AR蛋白表达，分别位于96、86 ku处。用GST标签抗体作为一抗时，3种质粒的诱导后细菌裂解液与纯化蛋白均能被GST标签抗体检测出，且GST空载组蛋白经过纯化后杂带消失，仅在26 ku处出现一单一条带。重组质粒表达的截短体AR融合蛋白在目的位置大小处存在目的条带(图4，红色箭头指示处)。EMSA结果显示荧光游离探针与AR-NTD+DBD、AR-NTD融合蛋白复合物泳带较GST组显著滞后(图4B)，证明两个融合蛋白经纯化后在体外具有与DNA直接结合的功能。
图3 考马斯亮蓝染色分析pGEX-4T-1空载和AR各重组质粒的诱导表达
图4 Western blot与EMSA鉴定各融合蛋白表达及其功能
本文详述了构建重组质粒与诱导原核蛋白表达的实验过程，针对其中的重难点以及所遇到的问题，总结得出以下结论：① 设计高特异性的引物是PCR实验成功的关键。② 在重组质粒的构建过程中，连接效率与DNA和载体比例密切相关，适当提高DNA比例或能得到更高的连接效率。过长的目的基因也是连接效率低下的重要原因，结果显示在同一连接体系条件下，短片段DNA更易与载体重组成功。③ 为避免影响后续实验进度，应严格验证重组质粒。以菌液为模板扩增目的片段可能出现假阳性，需行双酶切鉴定。在菌液PCR与双酶切鉴定双阳性的情况下，有一定概率出现碱基缺失或增补造成突变。所以为确保载体正常表达，测序结果才是验证重组质粒是否构建成功的金标准。分析测序结果需同时对核苷酸和氨基酸序列进行比对，分析有无移码、无义或点突变。本研究对ARΔLBD-pGEX-4T-1重组质粒测序结果进行核苷酸的同源比对时，显示其发生了移码突变，但鉴于与AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1相比较前者在结构上仅缺少铰链区，而非AR的重要功能域，故在两次测序错误后未重新构建。④ 诱导表达实验中，诱导温度、时间、转速及诱导剂浓度都会影响菌株表达目的蛋白的能力，预实验中可以在不同时间点留取菌液以摸索出最佳的目的蛋白表达条件。通过降低温度与诱导剂浓度，能在一定程度上减小诱导剂对菌体生长的毒性作用，且摇培过程需保障足够的菌通气量。也有部分蛋白即使在插入片段无误的情况下，仍无法诱导表达出蛋白。实验结果显示，不同表达载体与不同长度的基因插入片段都会影响细菌蛋白的表达。分子量越大的GST融合蛋白越难表达，例如在诱导129 ku的GST融合AR全长蛋白表达时，出现了仅表达GST，不表达目的蛋白的情况。此外，细菌沉淀的充分裂解超声是纯化蛋白纯度和浓度的基本保证。⑤ 蛋白纯化实验需严格在冰上操作，并补加蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。本研究通过Western blot分析明确了AR蛋白的特异性，但泳道中同时也出现了一些小于目的蛋白分子量的蛋白杂带，在实验操作规范的前提下，综合分析认为此蛋白杂带是由于载体本身性质所致的无法避免的蛋白降解条带，载体起始密码子的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点的间隔序列，导致其在第二点起始翻译。后续通过对目的基因进行密码子优化或更换载体等措施或能得到表达量更大、更稳定的融合蛋白。
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