杨何宝， 郭世奇， 尹守亮， 杨 明， 耿晓然*
利用强启动子对纤维二糖酶基因在里氏木霉中进行异源表达
杨何宝1， 郭世奇1， 尹守亮2， 杨 明1， 耿晓然3*
（1. 中溶科技股份有限公司，河北 唐山 063000；
2. 华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063000；
3. 河北兆惠恒美检测技术有限公司，河北 唐山 063000）
为提高里氏木霉中纤维二糖酶的表达量，构建了含有不同强启动子的纤维二糖酶基因重组质粒，以根癌农杆菌介导的方法将表达元件整合到里氏木霉基因组中，获得了高效表达纤维二糖酶基因的里氏木霉优势菌株。采用反转录的方法从黑曲霉RNA中克隆得到纤维二糖酶基因（cb）的编码序列，并以启动子Pcbh1和Pxyn1控制cb基因的表达，通过根癌农杆菌介导转化，成功将表达元件整合到里氏木霉基因组中。通过对不同启动子控制下的阳性转化子进行发酵筛选，纤维二糖酶活性最高比对照分别提高了376%和323%。通过水解纤维素实验，重组菌株表达的纤维素酶能更好的对纤维素进行水解，水解率比对照菌株分别高出了29.73%和26.78%。该研究成果对解决里氏木霉表达纤维二糖酶低的问题具有一定的指导意义。
启动子；
纤维二糖酶；
里氏木霉；
根癌农杆菌；
异源表达
纤维二糖酶，又称β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），是纤维素酶系的成分之一，其作用是将由内切葡聚糖酶（EG）和外切葡聚糖酶（CBH）作用产生的纤维二糖和其他寡糖分解成葡萄糖和其他单糖[1]。然而，纤维二糖酶仅占里氏木霉总分泌蛋白的1%[2]。低浓度的纤维二糖酶限制了纤维二糖等其他纤维寡糖向葡萄糖的转化，而纤维二糖和纤维寡糖的积累会导致对纤维素酶反应的反馈抑制[3-4]。因此，纤维二糖酶在纤维素降解过程中起着至关重要的作用，提高纤维素酶体系中纤维二糖酶的表达是提高纤维素糖化率的关键。
为了提高纤维二糖酶的表达量，有学者尝试对不同来源的纤维二糖酶基因在细菌、酵母和真菌中进行了异源表达[5]。Zhang等将纤维二糖酶基因在里氏木霉中进行表达，纤维二糖酶活力比对照提高了5.7倍，但仍处于降低的水平不能满足生产需要[6]。有研究表明，里氏木霉中的纤维二糖酶活性与滤纸酶活性的比值达到0.05以上才能表现出较好的水解性能[7]。王冰冰等[8]通过将来源于黑曲霉的纤维二糖酶基因在里氏木霉中进行异源表达，提高了纤维二糖酶活性与滤纸酶活性的比值，最高达到了1.22，重组纤维二糖酶活力为5.3 IU/mL，虽然较对照菌株有很大的提高，但酶活力仍然较低。
因此，增强纤维二糖酶活力是提高纤维素酶水解率和葡萄糖产量的关键措施之一。有研究结果表明，用黑曲霉分泌的纤维二糖酶酶制剂补充到里氏木霉的纤维素酶制剂中可以显著提高纤维素水解产率[9-10]。在前期的研究中，本团队已筛选到一株高产纤维二糖酶的黑曲霉菌株。本文将从此黑曲霉菌株中克隆纤维二糖酶基因，采用基因工程技术，利用里氏木霉中的cbh1和xyn1基因的启动子对纤维二糖酶进行表达，并以此构建并筛选出高产纤维二糖酶的里氏木霉生产菌株。
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌（DH5α）和根癌农杆菌AGL1购自北京聚合美公司，里氏木霉（KQ）和黑曲霉（）为本实验室保存菌种。
pPK2质粒为本实验室保存。
1.1.2 培养基
黑曲霉诱导培养基：蛋白胨1 g，纤维二糖0.4 g，MgSO40.05 g，KH2PO40.1 g，定容至100 mL，115℃灭菌30 min。此培养基用来诱导黑曲霉表达纤维二糖酶。
里氏木霉种子培养基：葡萄糖 2.5 g，玉米浆粉1.25 g，种液营养盐溶液100 mL，置于500 mL三角瓶，磁力搅拌下充分溶解，用20%氢氧化钠调pH 4.8，115℃灭菌30 min。
里氏木霉发酵培养基：玉米淀粉稀酸水解液3.5%（未过滤，115℃灭菌20 min，灭菌后合瓶），玉米浆干粉0.8%，酵母粉0.5%，乳清粉2%，微晶纤维素粉1.0%，大豆皮0.8%，玉米皮1.2%，玉米芯粉1%，豆粕0.5%，磷酸0.25%，硫酸钾0.17%，七水硫酸镁0.17%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.41%，微量元素0.2%，吐温-80 0.1%，pH4.3，装量100 mL/500 mL三角瓶，121℃灭菌30 min，接种量10%，25.0℃，185 r/min培养。
1.1.3 主要试剂和仪器
DNA mix聚合酶，购自北京兰博利德公司；
限制性内切酶、Gibson组装试剂、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、去磷酸化试剂购自NEB公司；
真菌基因组提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR&DNA片段纯化试剂盒购自北京聚合美公司；
DNA maker、Protein maker 购自康为世纪公司；
Yeast和Tryptone 购自OXOID公司；
其他为国产分析纯试剂；
PCR仪购伯乐公司；
核酸电泳仪、蛋白电泳仪和凝胶成像仪购自北京六一公司。
1.1.4 PCR 引物
本实验所用PCR引物如表1所示。
表1 引物序列
1.2 方法
常规分子生物学操作参照《分子克隆手册》。
1.2.1 提取黑曲霉总RNA
将黑曲霉孢子接入诱导培养基中，30℃培养48 h，菌丝体经液氮冷冻研磨后，采用RNA提取试剂盒提取黑曲霉总RNA，提取后进行核酸电泳，电泳条件为160 V，10 min。
1.2.2 黑曲霉纤维二糖酶基因（cb）的克隆
采用快速反转录试剂盒获取cDNA文库，然后以cDNA为模版，设计引物进行PCR，最终获得纤维二糖酶基因编码序列cb；
再以cb为模版，设计用来构建不同启动子和终止子的引物cb-F1&R1和cb-F2&R2进行PCR，分别获得cb1和cb2基因片段。
PCR反应体系：DNA mix 10 μL，上、下游引物（10 ng/μL）各0.4 μL，DNA模版（10 ng/μL）0.2 μL，DMSO 0.8 μL，灭菌水8.2 μL，总体积为20 μL。
PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变形30 s，50℃退火1 min，72℃延伸10 min，循环20次，72℃再延伸20 min，4℃保存。
反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR扩增的纤维二糖酶基因序列。
1.2.3 启动子Pcbh1和Pxyn1及其对应的终止子Tcbh1和Txyn1的克隆
利用真菌基因组提取试剂盒提取里氏木霉基因组，以里氏木霉基因组为模版，设计引物进行PCR，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证，然后采用PCR&DNA 片段纯化试剂盒回收目的基因。
PCR反应体系和条件同“1.2.1”。
1.2.4 pPK2质粒线性化
pPK2质粒用Hind Ⅲ酶进行单酶切及去磷酸化。
单酶切体系：酶5 μL，Buffer 5 μL，DNA 2 μg（依浓度计算）水补齐至50 μL，37℃，3 h。
去磷酸化体系：去磷酸化酶0.5 μL，Buffer 5 μL，酶切产物30 μL，DDW补齐至50 μL。
1.2.5 重组质粒构建
重组质粒构建采用Gibson组装试剂盒对片段和载体进行组装。载体为线性化的pPK2质粒，片段为纤维二糖酶基因、不同的启动子和终止子。
Gibson连接组装体系：组装mix酶5 μL，载体和片段共5 μL，比例为1∶3-5，金属浴50℃，孵育1 h。
1.2.6 重组质粒转化大肠杆菌DH5α
将10 μL连接产物与100 μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30 min，42℃热激90 s，立即重置于冰上3～5 min，再加入700 μL LB液体培养基，37℃、160r/min培养50～60 min；
涂布于LB固体平板（含10 μg/mL卡纳霉素），37℃培养过夜。
1.2.7 菌液PCR鉴定
在超净台中挑取若干单菌落至 LB 液体培养基中，37℃振荡培养6～8 h后，以引物cb-F1、Tcbh1-R和引物cb-F2、Txyn1-R分别作为鉴定引物，进行菌液PCR，验证质粒构建及转化情况。
1.2.8 重组质粒酶切验证
为了进一步验证重组质粒构建的准确性，选择合适的限制性内切酶对重组质粒进行酶切验证。酶切体系：内切酶1 μL，Buffer 2 μL，DNA 2 μL，ddH2O补齐至20 μL，37℃金属浴，酶切1 h。
1.2.9 重组质粒转化根癌农杆菌
采用冻融法将验证正确的重组质粒导入到根癌农杆菌中[11]。
1.2.10 根癌农杆菌转化子菌液PCR验证
验证方法同“1.2.7”。
1.2.11 里氏木霉孢子萌发液的制备
将新鲜培养的里氏木霉用无菌水将孢子洗下，稀释到1.0×106个/mL，28℃培养6 h备用。
1.2.12 根癌农杆菌培养
1）将验证正确的含有载体质粒的农杆菌菌株AGL1在含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的YEB液体培养基中28℃振荡培养过夜，转速为200 r/min；
2）取1.5 mL过夜培养的农杆菌培养菌液，2 400 g，离心5 min，IM液体洗涤两次接种到5 mL含有乙酞丁香酮的诱导培养基（200 μM乙酰丁香酮AS）中，28℃，200 r/min振荡培养，直到达到期望的OD 600 nm下的0.6～0.8。
1.2.13 根癌农杆菌介导转化里氏木霉
将100 μL经诱导后的农杆菌培养菌液与100 μL里氏木霉孢子萌发液混合，均匀涂布到覆盖有大小适中经灭菌后的玻璃纸的含有200 μM乙酰丁香酮的IM琼脂培养基上，28℃培养2～3天。
1.2.14 里氏木霉转化子筛选及单菌落传代培养
为了进一步筛选阳性转化子，将含有转化子的玻璃纸倒扣到含有100 μg/mL潮霉素和200 μM头孢噻肟的PDA培养基上，28℃培养1天后小心撕掉玻璃纸，再培养1～2天。小心地挑取转化子划线于抗性PDA平板上，待长满板可进行下一步实验。
1.2.15 里氏木霉转化子发酵验证及酶活检测
种子培养基和发酵培养基的装液量均为50 mL/250 mL，将重组菌株和对照菌株的孢子分别接入种子培养基，28℃，200 r/min培养24 h。按10%的接种量分别接入发酵培养基中，28℃，180 r/min，发酵48 h。检测发酵液的纤维二糖酶及滤纸酶活力。
1.2.16 发酵液水解纤维素验证实验
以稀酸预处理后的玉米秸秆作为水解底物，底物浓度为25%，加酶量为反应总体积的0.2%，52℃，300 r/min，反应72 h。反应结束后，检测还原糖、葡萄糖、木糖、纤维二糖的含量。
1.2.17 滤纸酶活和纤维二糖酶的检测
根据中华人民共和国能源行业标准NB/T 13005-2016中检测滤纸酶活和纤维二糖酶的方法对上清液的酶活进行检测。
1.2.18 糖浓度的检测
采用高效液相色谱法（HPLC）检测水解液中不同糖的浓度。
2.1 黑曲霉总RNA提取及纤维二糖酶基因的克隆
利用“1.2.1”中所述方法提取黑曲霉总RNA，得到了具有三条带（28S、18S、5S）的总RNA，如图1所示。利用“1.2.2”中所述方法扩增纤维二糖酶基因，得到大小约为2.3 kb的DNA片段，如图2所示。DNA测序结果表明：该基因全长为2 367 bp，通过在NCBI官网进行序列比对，与黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶A基因有99.79%的同源性。
图1 黑曲霉总RNA电泳图
图2 纤维二糖酶基因电泳图
2.2 启动子Pcbh1和Pxyn1及其对应的终止子Tcbh1和Txyn1的克隆
利用“1.2.3”中所述方法获得两对启动子和终止子，如图3和图4所示。
M为maker条带，1为Pcbh1基因条带，2为Tcbh1基因条带
M为maker条带，1为Pxyn1基因条带，2为Txyn1基因条带
2.3 重组质粒的构建、转化及验证
利用Gibson组装试剂将线性化pPK2质粒与片段进行连接，得到两个重组质粒，分别命名为：pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1、pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1，质粒图谱如图5、6所示。
图5 pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒图谱
图6 pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1质粒图谱
重组质粒转化大肠杆菌DH5α，转化子生长情况如图7所示。
对转化子进行菌液PCR验证，pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒验证的条带大小为3 005 bp，pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒验证的条带大小为3 367 bp，电泳结果如图8所示。
①为转化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒的转化子
M为maker条带，1-3为pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒验证条带，4为pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1质粒验证条带
图8 菌液PCR验证电泳图
2.4 重组质粒酶切验证
选择EcoRV酶切位点对重组质粒进行酶切验证，进一步确定质粒构建的准确性，结果如图9所示，可见质粒被准确的切成两条带，经比对，条带位置正确。
M为maker条带，1-3为pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒酶切电泳条带，4为pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1质粒酶切电泳条带
2.5 重组质粒转化根癌农杆菌AGL1及验证
利用“1.2.10”中所述方法将构建完成的重组质粒转化到根癌农杆菌AGL1中，转化子生长情况如图10所示。可见质粒转化情况较好，转化子数量正常。
对转化子进行菌液PCR验证，结果如图11所示。通过比对，条带位置和大小符合预期。
①为转化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒的转化子
M为maker条带，1-5为pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒菌液PCR条带，6-10为pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1质粒菌液PCR条带
图11 菌液PCR电泳图
2.6 根癌农杆菌介导转化里氏木霉
将制备好的里氏木霉孢子液与培养好的根癌农杆菌共培养后，获得里氏木霉转化子，结果如图12所示，图中白色斑点为里氏木霉转化子。
①为转化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1质粒的转化子，②为转化pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1质粒的转化子
2.7 里氏木霉转化子发酵验证
通过对获得的大量转化子进行摇瓶发酵，筛选出以下高产菌株。结果如表2和表3所示。
表2 利用Pcbh1启动子表达cb基因转化子发酵情况
表3 利用Pxyn1启动子表达cb基因转化子发酵情况
由上述结果可知，重组菌株1-3和2-2均表现出较高的滤纸酶活和纤维二糖酶活性。纤维二糖酶活性分别为12.634 U/mL和11.226 U/mL，比对照菌株分别提高了376%和323%。
2.8 纤维素水解验证
以稀酸预处理后的秸秆纤维素作为底物，分别用1-3、2-2和对照菌株的发酵液上清进行水解反应，结果如表4所示。由结果可知，两株重组菌株所产酶均表现出较好的水解性能，提高了糖浓度和水解率，水解率分别为85.51%和82.56%，比对照菌株高出了29.73%和26.78%。
表4 不同发酵液水解纤维素结果
2.9 本研究结果与其他相似研究对比
里氏木霉作为纤维素酶制剂的主要生产菌种，广泛应用于工业生产中。但商业化的纤维素酶制剂中，虽然内切型及外切型葡聚糖酶的活力较高，但纤维二糖酶活力很低。这就导致了实际应用中纤维二糖的积累而产生反馈抑制，影响水解效率。所以，提高里氏木霉产纤维二糖酶的能力，对于改善纤维素酶复合水解性能、提高纤维素酶的催化效率，从而提高纤维素原料的糖转化率，促进纤维素酶在生物质能研发方面的实际应用，具有重要的意义。
本文所用的强启动子Pcbh1和Pxyn1，已被广泛应用于里氏木霉同源或异源的蛋白表达[17-18]。由表2和表3结果显示，筛选出的阳性转化子菌株的纤维二糖酶活性最高可达到12.634 U/mL和11.226 U/mL，比对照菌株分别提高了376%和323%。虽然，相比于商品化的纤维二糖酶产品，本研究中的纤维二糖酶活性仍偏低，但相比于商业化的酶制剂，其具有更多的实用性和可操作性，具体表现在：产酶发酵结束后，经离心或者板框过滤去除菌体后，发酵上清就可直接用于纤维素水解反应，无需进行浓缩等其他复杂处理，并能达到较高的水解效率。由表5对比可知，本研究中所采取的改造策略对里氏木霉的纤维二糖酶活性和滤纸酶活性均有很大的提高；
如上文所述，酶活性虽不及有些研究结果，但此工程菌株实用性强，发酵液上清可直接用于水解实验，并可达到较高的水解效率。
表5 不同文献结果对比
有研究表明[9]，在纤维素原料水解过程中，当纤维二糖酶活性与滤纸酶活性的比值达到0.3以上时，纤维素二糖将有效地转化为葡萄糖。由表2和表3结果显示，筛选出的阳性转化子菌株的滤纸酶活最高可达21.94 U/mL和20.56 U/mL，分别比对照菌株提高了26%和18%。重组里氏木霉菌株的纤维二糖酶活性与滤纸酶活性的比值最高可达0.58和0.55，均高于宿主菌株（0.15）。这说明，重组菌株的纤维素酶系中存在更多的纤维二糖酶，改善了纤维素酶复合体系。
由表4可知，对照菌株的水解液中葡萄糖和木糖的浓度均较低，水解产率仅为55.78%。而纤维二糖和其他糖的浓度相对较高，说明在反应体系中纤维二糖酶活性偏低，从而导致纤维二糖和其他寡糖的积累。而对于重组里氏木霉菌株，纤维二糖被迅速水解，消除了纤维二糖积累引起的反馈抑制。因此，水解物中葡萄糖的浓度均明显增加，水解率提高到85.51%和82.56%，比对照菌株高出了29.73%和26.78%。这些结果表明，重组里氏木霉菌株产生了更有效更协调的酶复合体系来水解纤维素底物。
本研究中，通过反转录手段从黑曲霉基因组中成功克隆到纤维二糖酶基因（cb）的编码序列，通过ncbi官网比对，该序列与黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶A基因有99.79%的同源性。将cb基因编码序列分别与里氏木霉的两对启动子Pcbh1、终止子Tcbh1和启动子Pxyn1、终止子Txyn1重组构成两个不同的表达元件，利用根癌农杆菌介导转化，将两个表达元件分别整合到里氏木霉基因组上，并使其进行高效表达。发酵试验表明，纤维二糖酶基因在Pcbh1和Pxyn1两个强启动子的作用下均可高效表达。发酵48 h，不同启动子重组菌株的纤维二糖酶活力可以高达12.634 U/mL和11.226 U/mL，是原始菌株的4.76和4.23倍。该项研究成果改善了里氏木霉的纤维素酶系，使可再生资源的酶法糖化得到长足的进展，从而将推动纤维素乙醇的产业化进程。
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Heterologous Expression ofGene inusing Strong Promoters
YANG He-bao1, GUO Shi-qi1, YIN Shou-liang2, YANG Ming1, GENG Xiao-ran3*
（1. Zhongrong Technology Co., Ltd, Tangshan 063000, China; 2. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;3. Hebei Zhaohuihengmei Testing Technology Co., Ltd, Tangshan 063000, China）
In order to increase the expression of cellobiase in, the target gene expression elements containing different promoters were integrated into the genome ofbymediated method, and dominant strains ofwith high expression ofgene were obtained. The coding sequence of the cellobiase gene (cb) was cloned fromRNA by reverse transcription method, and the cb gene expression was controlled by the promoters Pcbh1 and Pxyn1. The expression elements were successfully integrated into the genome ofthroughmediated transformation. By screening the positive transformants controlled by different promoters, theactivity was increased by 376% and 323% respectively compared with the control. Through the cellulose hydrolysis experiment, the cellulase expressed by the recombinant strain can better hydrolyze cellulose, and the hydrolysis rate is 29.73% and 26.78% higher than that of the control strain respectively. The research results have certain guiding significance for solving the problem of low expression ofby.
promoter;;;; heterologous expression
Q815
A
1004-8405(2022)04-0039-11
10.16561/j.cnki.xws.2022.04.07
2022-12-07
杨何宝（1987～），男，河北迁安人，硕士，助理研究员；
研究方向：微生物。
通讯作者：耿晓然（1989～），女，河北迁安人，硕士，助理研究员；
研究方向：微生物。122996365@qq.com