樊红灯 ，王龙威 ，白俊艳 *，韩志松 ，何豫涵 ，李静云 ，卢小宁 ，陈梦柯 ，曾凡林 ，王建华
（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023；
2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳471023；
3.辽宁省沙地治理与利用研究所，辽宁 阜新 123000；
4.内蒙古赤峰市元宝山区平庄镇人民政府，内蒙古 赤峰 024076）
生长激素释放激素 (growth hormone releasing hormone，GHRH)具有促进动物生长发育，提高新陈代谢的功效[1]，而且GHRH还可以促进肌肉生长、分解体内脂肪[2]。GHRH基因已被证明与家畜的生理活动、生长性状等有显著关联性，是影响家畜生长性能等的重要基因之一。GHRH基因多态性已被证明与猪的背膘厚、日增重、胴体肉含量、肉色和保水能力有关[3]。作为中国独有的品种——小尾寒羊，其皮毛精美，肉质鲜嫩可口，营养丰富，深受国内外市场青睐[4]。本研究以我国小尾寒羊为研究对象，对GHRH基因的多态性以及小尾寒羊GHRH基因的多态性与其生长性状关联性进行分析，检测GHRH基因的InDel多态性，并与小尾寒羊生长性状进行关联分析，以此来探讨GHRH基因对小尾寒羊生长性状的影响。
1.1 试验材料
选取了辽宁省沙地治理与利用研究某牧业公司阜新市种羊场的小尾寒羊164只，所有羊只均在相同环境下饲养。对颈静脉采集的10mL小尾寒羊血液样本进行ACD枸橼酸抗凝处理并置于冰盒中 [血液与ACD 的比例为 5∶1(V/V)]，-20 °C 保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 生长性状指标测定。利用常规方法对小尾寒羊的生长性状指标进行测定，测定指标包括羊的宰前活重、宰后胴体重、体高、体长、胸宽、胸围、管围、尻高、臀端高、前肢高、头长、尻长、颈长、额宽、腰角宽、臀端宽、胸深、头深、腹围、腿臀围和背高。
1.2.2 基因组DNA提取。取出绵羊血样解冻后，按照全血基因组DNA试剂盒说明书提取绵羊血液DNA，用超微量核酸浓度测定仪检测DNA的浓度和纯度，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。根据DNA样品纯度和浓度将DNA稀释至100ng/μL，分装至EP管中，-20℃保存备用。
1.2.3 引物设计。引物信息参考Wu等[5]论文里的引物序列，由郑州鼎国生物技术有限公司合成。
表1 引物序列信息
1.2.4 GHRH基因PCR扩增。PCR扩增体系15μL；
上下游引物各 1 μL，DNA2 μL，2×Tap PCR Master Mix7.5μL，ddH2O4.5μL。PCR扩增产物用3%琼脂糖凝胶进行检测。
图1 琼脂糖凝胶电泳检测图
1.2.5 数据处理及统计分析。利用SPSS26.0统计学软件分析不同基因型与生长性状的关联性，最后将关联结果以图的形式列出。
2.1 PCR扩增结果
PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测，共检测到两种基因型，分别为II(165bp)基因型和DD(159bp)基因型。其中DD基因型频率为0.4375，II基因型频率为0.5625。
2.2 GHRH基因与小尾寒羊生长性状的关联分析
小尾寒羊GHRH基因的不同基因型与生长性状的关联分析结果见表2。由表2可知，DD基因型小尾寒羊的尻高、前肢高和颈长显著大于II基因型(P<0.05)；
II基因型小尾寒羊的胸围和腹围显著大于DD基因型(P<0.05)。小尾寒羊群体DD基因型和II基因型个体羊的宰前活重、宰后胴体重、体高、体长、胸宽、管围、臀端高、头长、尻长、额宽、腰角宽、臀端宽、胸深、头深、腿臀围和背高虽然有差异，但是差异不显著(P>0.05)。
表2 GHRH基因与小尾寒羊生长性状的关联分析
3.1 GHRH基因是动物生长发育相关的重要功能候选基因
Meng等[6]的研究表明，可以通过外部注射GHRH表达质粒的方法来提高羊的生长速率和增重。褚晓红等[7]的试验结果表明，猪的GHRH基因与猪的采食有遗传连锁关系，GHRH基因是影响猪采食及生长的重要候选基因。为了探讨GHRH基因去除(GHRH敲除，GHRHKO)导致的GHRH缺乏对小鼠情绪行为的影响，Sheila等[8]经研究发现，GHRHKO小鼠探索性活动增强；
在开阔场试验(P<0.005)、亮暗箱试验(P<0.005)和高架加迷宫试验(P<0.05)中，GHRHKO小鼠焦虑相关行为减少；
此外，与对照组相比，GHRHKO小鼠在强迫游泳试验和尾悬试验中静止时间显著减少(P<0.0001)。这些结果表明，雄性小鼠GHRH缺乏会增加体力活动，减少焦虑和抑郁相关行为。Zhang等[9]采用PCR-SSCP和测序技术检测秦川牛和南阳牛的GHRH基因突变，秦川牛和南阳牛C等位基因频率分别为 0.8778 和 0.8476，新突变 1 个(C>T)。Iwona等[10]使用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)技术共对242头波兰荷斯坦牛和185头纯种泽西牛进行基因分型，并对波兰荷斯坦州奶牛和泽西岛奶牛的产奶特性进行了分析。结果表明，基因型中含有1～2个GHRH等位基因的奶牛其生产的牛奶中脂肪含量更高。
3.2 GHRH基因与绵羊生长性状的关联分析
袁晓峰等[11]研究了萨福克羊与哈萨克羊杂交成年母羊GHRH基因位点的多态性及其与生长性状的关联性。结果显示，GHRH基因2个SNP位点多态性对哈×萨羊的杂交成年母羊生长性能具有一定的影响，可以作为辅助育种的候选基因。肖礼华等[12]研究表明，GHRH-R基因可以作为黔北地区麻羊体重筛选的分子标记。本研究表明，II基因型小尾寒羊的胸围、腹围显著大于DD基因型(P<0.05)；
DD基因型小尾寒羊的前肢高、尻高和颈长显著大于II基因型(P<0.05)。结果证实了GHRH基因与小尾寒羊生长发育的相关性，可以作为本土小尾寒羊遗传杂交改良的重要功能候选基因。