邓聿杉，徐 莺
(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室, 成都 610065)
核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins,RIPs)是一种rRNA N-糖苷酶，它能够催化28S rRNA特定位点上腺嘌呤的糖苷键断裂从而抑制蛋白质的正常合成[1].此外，这种蛋白还具有抗病毒，抗肿瘤，抗真菌等多种生物学活性，因此也受到了科研人员的广泛关注[2].
Curcin和Curcin C均是从麻疯树(Jatrophacurcas)中分离得到的核糖体失活蛋白.1976年Stripe首次从麻疯树胚乳中分离出Curicn[3]，Barbieri等人将其鉴定为Ⅰ型RIPs[4].2017年Zhang等人从麻疯树的子叶中分离纯化出了一种新型的RIP并将其命名为Curcin C[5].研究表明，两种蛋白体外翻译抑制的IC50分别是0.19 nmol/L和0.05 nmol/L，这表示它们两者之间的N-糖苷酶活性可能存在差异[5,6].为了了解Curcin和Curcin C N-糖苷酶活性的主要差异，我们实验室于2019年通过SWISS_MODEL对两种蛋白质的三级结构进行了预测，并使用AutoDock将两种蛋白与腺嘌呤进行了分子对接，通过LigPlot+对腺嘌呤与Curcin及Curcin C之间的互作方式进行了分析.受限于当时蛋白质结构预测技术的不成熟，预测得到的三级结构质量并不高.此外，当时在进行分子对接前并未对Curcin及Curicn C的活性位点信息进行预测而是直接进行对接，这也导致了对接结果并不理想，最终得到的互作方式和其它已知RIPs与腺嘌呤的互作模式之间具有明显差异.
如今，许多结构生物学领域的生物信息学软件不断被开发出来，蛋白质结构预测技术也愈发成熟，这为完善之前的研究提供了良好的实验条件.为了得到更加准确的结论，本文使用新的蛋白质预测方法对Curcin和CurcinC的三级结构进行预测，使用质量评估软件对预测结果进行了质量评估，在对接前预测了两种蛋白活性位点的氨基酸组成信息，最后使用分子对接方法探究了Curcin和Curcin C与腺苷及腺嘌呤之间的相互作用模式，并对对接结果进行了比较分析，为阐明两种蛋白N-糖苷酶活性差异的潜在机制提供了更为可靠的理论基础.
麻疯树核糖体失活蛋白Curcin(Genbank登记号：NP_001295744.1)和Curicn C(Genbank登记号：XP_012074358.2)的氨基酸序列从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索获得.蓖麻毒素A链与腺嘌呤的晶体复合体结构从PDB数据库(PDBID：2p8n)中检索获得.
2.2 方 法
2.2.1 蛋白质三级结构预测 利用蛋白质三级结构预测软件trRosetta[7]预测Curcin和Curcin C的三级结构.
2.2.2 模型质量评估 为了确保预测得到的蛋白质模型具备较高的质量以保证后续分析结果的有效性，本文采用PROCHECK[8]及Qmean[9]两款质量评估软件对预测模型进行了质量评估.
2.2.3 小分子配体的预处理 从PubChem数据库中下载腺嘌呤的2D结构，使用Chem3D将2D结构转化为mol2格式后进行能量最小化处理.
2.2.4 活性位点信息预测 使用UCSF Chimerav.1.12.1[10]预测Curcin和Curcin C的活性位点信息：使用MatchMaker将Ricin分别与Curcin和Curcin C进行蛋白质叠合，并基于结构进行序列比对，以Ricin活性位点信息为参考预测Curcin和Curcin C的活性位点信息.
2.2.5 分子对接 分子对接使用AutoDock4.2，预测Curcin和Curcin C与腺苷及腺嘌呤之间的相互作用模式.对蛋白质进行预处理：加氢，计算电荷，转换为PDBQT格式；
根据预测得到的活性位点信息设置GridBox.受体蛋白设置为刚性，小分子配体设置为柔性.对接算法选用遗传算法(Genetic Alogorithm)寻找配体合适的结合取向.
3.1 Curcin和Curcin C的三级结构的质量评估
采用PROCHECK和Qmean两款质量评估软件对Curcin和Curcin C的三级结构(图1a，图1b)进行质量评估.PROCHECK的评估结果以拉氏图的形式呈现给用户，结果显示Curcin的所有氨基酸残基中有89.4%位于拉氏图的最可信区域，10.3%的氨基酸残基位于次级可信区域，0.4%的氨基酸位于不可信区域(图1c).Curcin C的所有氨基酸中有86.3%位于拉氏图的最可信区域，13.4%的氨基酸位于次可信区域，0.4%的氨基酸位于允许区域(图1D).通常情况下蛋白质模型的氨基酸残基中位于最可信区域及次级可信区域的氨基酸总数占比超过90%就表示被评估的结构具备较高的质量.Qmean将评估对象与PDB数据库中具有类似大小的非冗余结构进行比较，评估结果同样以图表形式返回给用户，同时还会将评估结果量化为Qmean Z-Score.Qmean评估结果显示，Curcin和Curcin C模型的Z-Score得分分别为-0.01和-1.16，两者的得分都位于|Z-Score|<2的范围内(图1E,图1F)，这意味着两种蛋白的三级结构也同样通过了Qmean的质量评估.PROCHECK及Qmean的评估结果一致显示Curcin的模型质量要略高于Curcin C，但两者的三级结构都通过了两款软件的评估标准，因此trRosetta预测得到的两种蛋白质模型都具备较高质量，可以用于后续的实验分析.
图1 基于trRosetta预测的Curcin和Curcin C三维结构示意图
3.2 Curcin和Curcin C的活性位点的预测
在分子对接之前需要确定腺嘌呤与Curcin和CurcinC结合的活性位点才能确保对接结果具有更高的准确性.本文采用UCSF Chimera v.1.12.1软件以RicinA链为参考模型，将RicinA与Curcin和CurcinC基于结构进行比对(图2)，根据比对结果及RicinA的活性位点信息预测得到了两种蛋白活性位点的氨基酸组成信息.预测结果显示，Curcin和CurcinC活性位点处的氨基酸组成完全一致，分别由Ala117，Tyr118，Leu119，Phe131，Gly157，Ser158，Tyr159，Pro208，Glu209以及Arg212共10个氨基酸组成.
图2 Ricin C原子与Curcin和Curcin C叠加的立体带状图
3.3 与腺苷及腺嘌呤分子的对接研究
为了比较Curcin及Curcin C的活性位点在发挥N-糖苷酶活性过程中的结构差异，本文将Curcin与Curcin C分别与腺苷及腺嘌呤两种底物进行分子对接，对反应前后的两种状态进行对接分析.对接结果选用LigPlot+进行可视化分析(图3).经AutoDock计算，Curcin与腺嘌呤之间的结合能大小为-4.92 KJ/mol,参与氢键相互作用的氨基酸分别是Leu119和Gly157，参与疏水相互作用的氨基酸有Ala117,Tyr118,Tyr159，Phe162以及Ile204.Curcin C与腺嘌呤之间的结合能大小为-5.18 KJ/mol，参与氢键相互作用的氨基酸有Leu119，Gly157以及Arg212,参与疏水相互作用的氨基酸有Tyr118，Phe131，Tyr159以及Ile204.不难发现，Curcin C与腺嘌呤之间的结合能要低于Curcin，但两者之间结合能大小差异并不明显，还不足以造成两者在体外翻译抑制能力上产生明显差异.因此，两种蛋白与腺嘌呤之间的结合能差异可能只是导致两者体外翻译抑制能力上产生明显差异的原因之一.
图3 Curcin和Curcin C与腺苷及腺嘌呤的相互作用示意图
Curcin与腺苷之间的结合能大小为-5.65 KJ/mol，参与氢键相互作用的氨基酸有Tyr118,Leu119,Gly157,Glu209和Glu238,参与疏水相互作用的氨基酸残基有Tyr159,Ile204和Arg212.Curcin C与腺苷之间的结合能大小为-6.07 KJ/mol，参与氢键相互作用的氨基酸残基有Tyr118,Leu119,Glu209,Arg212和Glu238,参与疏水相互作用的氨基酸有Gly157,Tyr159和Ile204.可以发现两种RIPs与腺苷的结合能均低于腺嘌呤.
通过Curcin和Curcin C对接结果的比较分析，我们还发现Curcin和Curicn C与腺苷及腺嘌呤的相互作用模式具有较高的相似性，但是Curcin在与两种配体互作时都缺少一个关键氨基酸Arg的参与,而Arg在RIPs的活性位点中往往起着非常重要的作用.为了进一步探究Curcin与腺嘌呤相互作用时Arg缺失的原因，我们将Curcin和Curcin C结合口袋中Arg与底物腺嘌呤中N3原子之间的距离进行了测量(图4).结果显示Curcin中Arg与腺嘌呤的N3原子之间的最短距离为3.5 Å而Curcin C中Arg与N3原子之间的距离为2.79 Å，这意味着Curcin中Arg与腺嘌呤相互作用的缺失很有可能是因为两者在距离上相距较远造成的，这会影响Arg对N3原子的质子化作用从而阻碍N-糖苷酶反应的正向进行.
图4 腺嘌呤N3原子与Curcin和Curcin C活性位点处Arg的距离测量示意图
相较于先前的实验，本次研究所采用的蛋白质结构预测软件trRosetta预测得到的Curcin和CurcinC模型的质量更高，PROCHECK评估结果显示Curcin和CurcinC位于不可信区域以外的氨基酸占比分别为99.6%和100%(之前研究中Curcin和Curcin C的占比分别为98.1%和97.8%).此外，两个蛋白模型都通过了Qmean的质量评估(之前研究中Curcin和Curcin C都未通过).这表明本次实验所使用的三级结构质量更高，使用该模型进行后续分析得到的结论也应该更具有说服力.本次研究还加入了活性位点预测的步骤，活性位点是小分子配体与受体结合的位置，该位置的确定能够进一步限制对接空间，有效降低了小分子配体在活性位点之外结合的概率，进而提高对接结果的精确度.此外，本次实验不仅考虑了反应后受体与配体的相互作用，即腺嘌呤与Curcin及Curcin C的相互作用，还考虑了反应前受体与配体之间的相互作用，将腺苷与两种RIPs进行了分子对接，分析了造成Curcin与Curcin C N-糖苷酶活性差异的可能原因，从N-糖苷酶机制入手对活性位点处的关键氨基酸进行了分析.
从对接结果中我们发现，Curcin和Curcin C与腺苷之间的结合能普遍低于腺嘌呤，通常情况下结合能越低产物越稳定，这就意味着Curicn与Curcin C更容易与腺苷相结合.理论上，在RIPs发挥脱嘌呤作用时结合位点结合的底物应该是完整的腺苷，糖苷键断裂后形成才形成了腺嘌呤与RIP的复合体，随后腺嘌呤从结合口袋中脱落，RIP再与其它RNA的腺苷结合进行下一次的催化.这就意味着在RIP催化N-糖苷酶反应的过程中腺嘌呤与腺苷之间存在一种竞争抑制的关系，如果RIP与腺苷之间的结合能低于腺嘌呤则有利于反应的正向进行，若两者的结合能相近则会阻碍下一次反应的开始.Curcin与腺嘌呤及腺苷的结合能相差0.73 KJ/mol，Curcin C与腺嘌呤和腺苷之间的结合能相差0.89 KJ/mol，可以看出Curcin C与腺苷及腺嘌呤之间结合能的差异更加明显，这可能会导致腺苷在与腺嘌呤竞争Curcin C的活性位点时更加占据优势，进而提升了Curicn C的N-糖苷酶活性.
Frankel等人利用x射线结构指导了一系列Ricin的定向突变实验,他们发现Arg和Glu在RIPs发挥N-糖苷酶作用的过程中起着非常重要的作用[11].当Ricin中Arg 180转化为Gln时(R180Q)N-糖苷酶活性会降低2500倍，Glu 177转化为Gln(E177Q)活性降低至少170倍.这与Arg的质子化作用有关，研究表明，质子化作用可以明显降低N-糖苷键离子解离通道所需要的能量，降低其水解所需的活化能，稳定水解产物，极大的促进N-糖苷键的水解.RIP在与底物结合时,Arg就可以使腺苷的N3原子质子化，从而促进了N-糖苷键的水解.当N-糖苷键断裂后，腺嘌呤环上会聚集负电荷，碱基会聚集正电荷，Arg的质子化作用恰好可以中和腺嘌呤上的负电荷，Glu则促使水分子水解，水解产物氢氧根离子平衡碱基上的正电荷，最终达到使产物稳定的作用[12].从受体与配体之间的结合方式来看，Curcin在与两种配体互作时都缺少一个关键氨基酸Arg的参与,测量结果显示Curcin活性位点处Arg与腺嘌呤之间的距离要远于Curcin C.因此，Arg在Curcin和Curcin C活性位点处所处的位置也是造成两者N-糖苷酶活性差异的重要原因.
最终通过对接结果的比较分析，我们找到了三个可能造成Curcin C拥有更强N-糖苷酶活性的潜在原因.1.Curcin C与腺嘌呤及腺苷的结合能都要低于Curcin；
2.Curcin与腺嘌呤结合时，活性位点处的Arg与腺嘌呤的N3原子距离较远，不利于质子化作用，不利于N-糖苷键的水解；
3.Curcin C与腺苷及腺嘌呤之间的结合能差异更大，腺苷相较于腺嘌呤对活性位点具有更强的竞争力，有利于Curcin C在反应结束后快速参与到下一次反应中.