李 欢, 马武生, 孙长花
(扬州职业大学, 江苏 扬州 225009)
RIPK2是信号转导途径中关键的一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可介导多种细胞内信号转导的级联反应,参与病原相关分子模式引起的天然和获得性免疫反应,产生炎症细胞因子,调节细胞凋亡。早期研究显示RIPK2主要通过NOD/RIPK2通路进行免疫调节,是NOD/RIPK2通路关键且核心的基因[1]。激活NOD2:RIPK2 复合物可引起细胞自噬、抗原呈递以及信号通路的激活等一系列级联反应。这些级联反应中,NF-κB信号通路研究的最多,是NOD/RIPK2通路影响下游信号的最佳模型[2]。研究表明敲除RIPK2的巨噬细胞在LPS刺激时,NF-κB、JNK、p38信号通路被抑制,炎症细胞因子IL6和TNF-α以及趋化因子IP10表达量明显减少[3]。高表达RIPK2时可激活p38 MAPK通路,能更有效地清除大肠杆菌[4]。此外,RIPK2还可参与肺炎、连锁淋巴组织增生综合征、Blau 综合征、多发性硬化、哮喘等疾病,在呼吸系统免疫中发挥着重要作用。缺失RIPK2可导致肺脏中载菌量显著性增加[5],表明RIPK2在免疫反应调节中发挥着重要作用。而过多的免疫反应可引起不同程度的炎症反应,导致组织器官的不同损伤。有研究表明过高表达RIPK2可导致破坏性炎症反应,常见于继发性细菌感染[6]。因此,对RIPK2基因调控机制的研究将会有助于解释NOD/RIPK2通路参与宿主免疫应答反应以及对过度炎症的缓解机制。
表观遗传修饰是影响基因表达的一个重要因素。DNA甲基化作为一种常见的表观遗传修饰方式,可在DNA甲基转移酶的催化作用下,使CpG二核苷酸5’-胞嘧啶变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化会改变DNA构象,使DNA的大沟无法与DNA结合蛋白正常结合,使这些非编码区长期保持无表达活性的状态,从而控制基因表达。启动子DNA甲基化可通过阻碍转录因子与识别序列结合、结合甲基化CpG结合蛋白并募集辅阻遏复合物而形成转录抑制复合物等方式抑制基因的转录。基因启动子区甲基化通常被认为是阻碍转录起始的抑制性表观遗传学标记。例如,TFPI-2基因启动子区甲基化可沉默或下调基因表达,且启动子甲基化状态可以作为急性髓系白血病病情进展的指标[7]。此外,免疫应答及疾病相关基因启动子DNA甲基化与免疫系统功能和疾病的发生有着密切关系。TSP1基因启动子区的高甲基化与TGF-β1高表达相关,降低细胞免疫功能,可能参与贲门腺癌的发生[8]。因此,探寻鸡RIPK2基因甲基化水平的调控机理有助于控制过度炎症反应,缓解应激性病理损伤和提高家禽健康,具有一定的理论价值和实践意义。
1.1 试验材料及主要试剂
本研究中所涉及的材料和试剂如表1所示。
表1 试验材料和试剂
1.2 主要仪器
本研究中主要涉及的仪器有:CO2恒温培养箱,洁净工作台,倒置显微镜(IX51),台式离心机(TGL-16c),荧光酶标仪(Spark 10M),紫外仪(WD-9403C),核酸电泳仪(DyCP-31DN),PCR仪(TC-XP),核酸蛋白测定仪(ND-ONEW),荧光定量RT-PCR仪(QuantStudio 6 Flex System)。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养和试验分组
鸡巨噬细胞HD11复苏后添加至含10%的胎牛血清DMEM培养基,置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养,次日观察细胞生长情况传代培养。将干粉状5-氮杂胞苷溶解于DMSO中,PBS稀释至10 μmol·L-1浓度。处理前一天,将细胞铺至24孔培养板上,LPS(10 μg·mL-1)、5-氮杂胞苷(10 μmol·L-1)、CpG甲基转移酶M. SssI(50 U·mL-1)和PBS(2 μL)分别加入培养基中,孵育48 h后收集细胞。
1.3.2 引用设计与合成
登录NCBI数据库下载鸡RIPK2基因(NM-001030943.1)mRNA序列和基因组转录起始位点上游3000bp和下游200bp启动子序列。采用Primer premier 5.0软件设计qRT-PCR引物序列(表2);利用EMBOSS Cpgplot在线软件对鸡RIPK2基因启动子区域进行CpG岛预测。利用Primer premier 5.0软件设计焦磷酸PCR测序的引物,由武汉金开瑞生物工程有限公司合成,引物序列见表3。
表2 鸡RIPK2基因qRT-PCR引物
表3 鸡RIPK2基因启动子区焦磷酸测序引物
1.3.3 总RNA提取和荧光定量PCR
利用试剂盒TRIpure Total RNA Extraction Reagent提取鸡巨噬细胞HD11总RNA,核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度,利用反转录试剂盒EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit将1 μg总RNA反转录成cDNA产物。使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix试剂盒进行荧光定量PCR检测。反应体系为10 μL: 2×Master Mix 5 μL,引物工作液(2.5 μM)1μL,模板1 μL,ROX 1μL,ddH2O 2 μL。反应条件为95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环40次。以鸡RIPK2为检测基因,GAPDH为内参基因。每组3次重复。
1.3.4 基因组提取和亚硫酸氢盐处理
利用基因组DNA试剂盒提取鸡巨噬细胞HD11基因组,核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度。亚硫酸氢盐DNA甲基化采用Methylation-Gold Kit试剂盒进行(基因组DNA 500 pg-2 μg)。亚硫酸氢盐反应体系中,DNA 样品20 μL,缓冲液130 μL。反应条件:98 ℃,10 min;64 ℃,2.5 h;4 ℃,放置20 h。
1.3.5 鸡RIPK2基因启动子区CpG岛片段PCR扩增
PCR扩增鸡RIPK2基因启动子区-421 ～+21 bp CpG岛。扩增体系为20 μL: 2×HieffTM PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA 2 μL,ddH2O 16 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性4 min,95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(35个循环),72 ℃末段延伸10 min。
1.3.6 测序
将PCR扩增产物送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序,利用在线软件QUMA分析测序结果,判断目的片段中CpG岛位点是否发生甲基化。
1.3.7 统计分析
2.1 鸡RIPK2基因启动子区甲基化分析
在线软件EMBOSS Cpgplot预测结果显示,鸡RIPK2基因启动子区存在一个CpG岛,长度为513 bp,位于-421～+92 bp 处(符合CpG岛标准:观察者/期望值>0.6,C%+G%>50%,CpG岛长度>200 bp),具体见图1。
图1 鸡RIPK2基因启动子区CpG岛预测
2.2 LPS诱导鸡HD11细胞前后RIPK2表达量变化
定量qRT-PCR检测LPS诱导鸡HD11细胞前后RIPK2基因表达水平的变化。结果显示:相对于空白对照组,10 μg·mL-1LPS诱导鸡HD11细胞48 h后,鸡RIPK2基因mRNA表达量差异极显著(P<0.05);鸡RIPK2基因在LPS诱导48 h后,其表达量提高了4倍(图2)。
图2 LPS诱导前后鸡RIPK2在HD11细胞中的表达量注:不同小写字母表示组间差异显著,P<0.05
2.3 LPS诱导前后鸡RIPK2基因组DNA提取及PCR扩增
提取鸡巨噬细胞HD11基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳结果显示提取的基因组DNA条带明亮,整齐单一,无杂带(图3);且样品DNA浓度为258 ng·μL-1,OD260/OD280比值在1.8～2.0之间。结果说明样品DNA完整、质量较高,可用于后续试验。设计BSP引物对CpG岛进行PCR扩增,扩增片段长度为221 bp。琼脂糖凝胶电泳显示约在250 bp处有1条特异性条带(图4),与目标片段长度一致;后进行切胶回收,TA克隆后测序结果与预期序列一致。
图3 基因组DNA的电泳检测结果注:M:DL-2000 DNA 相对分子质量标准;1:阳性对照;2:LPS诱导组RIPK2基因片段
图4 鸡RIPK2基因PCR产物扩增片段电泳图注:M:DL-2000 DNA 相对分子质量标准;1:阳性对照;2:LPS诱导组RIPK2基因片段
2.4 LPS诱导前后鸡RIPK2基因启动子区CpG岛甲基化检测
对测序结果进行甲基化分析,计算不同处理组中DNA甲基化的概率,黑色圆圈表示甲基化的CpG位点,空心圆圈表示未甲基化的CpG位点,图5显示GpG岛位点甲基化状态。不同处理状态下,鸡RIPK2基因甲基化状态不同,且差异显著(P<0.05)。对照组中鸡RIPK2基因CpG位点甲基化水平为53.8%,而LPS诱导后甲基化水平为15.4%;下降了40.4%(图6)。这表明LPS刺激会降低鸡RIPK2基因甲基化状态,使RIPK2基因从抑制状态变为激活状态。
图5 LPS诱导前后鸡RIPK2基因启动子区甲基化图谱 注:黑色圆圈表示甲基化的CpG位点;空心圆圈表示未甲基化的CpG位点
图6 LPS诱导前后鸡RIPK2基因启动子区甲基化水平分析注:不同小写字母表示组间差异显著,P<0.05
2.5 5-氮杂胞苷和M. SssI对鸡RIPK2启动子活性及基因表达的影响
实时荧光定量qRT-PCR检测5-氮胞杂苷DNA甲基化抑制剂组、CpG甲基转移酶过甲基化组和对照组中鸡RIPK2基因启动子活性以及LPS诱导后这些组中RIPK2基因表达水平(图7、图8)。图7结果显示相比于对照组和CpG甲基转移酶组,5-氮胞杂苷组极显著性提高鸡RIPK2基因启动子活性(P<0.01);相比于加入RIPK2启动子质粒的对照组,CpG甲基转移酶组极显著性降低鸡RIPK2基因启动子活性(P<0.01)。图8结果显示相比于LPS诱导组,LPS诱导后加入DNA甲基化抑制剂显著性提高了鸡RIPK2基因的表达水平;而LPS诱导后加入CpG甲基转移酶M. SssI显著性降低了鸡RIPK2基因的表达水平。以上结果表明DNA甲基化抑制剂和CpG甲基转移酶可分别调控鸡RIPK2基因启动子活性,进而调控鸡RIPK2基因的表达水平。
图7 不同试剂对鸡RIPK2基因启动子活性的影响注:不同小写字母表示组间差异显著,P<0.05
图8 不同试剂对鸡RIPK2基因表达水平的影响注:不同小写字母表示组间差异显著,P<0.05
本试验检测了LPS诱导前后调控免疫炎症反应的RIPK2基因表达水平及甲基化状态。结果显示,LPS诱导前鸡RIPK2高甲基化;诱导后RIPK2低甲基化,激活基因表达,表明甲基化参与细菌感染前后基因的表达调控。同时,此结果与RIPK2基因的功能在理论上保持一致,即受外界刺激前RIPK2低表达(高甲基化抑制基因表达),受刺激后RIPK2基因被激活以有助于发生免疫炎症反应(低甲基化激活基因表达)。
基于此结果甲基化影响RIPK2基因表达,检测了甲基化相关试剂对RIPK2表达的影响。5-氮杂胞苷,DNA甲基化转移酶抑制剂,可在DNA复制时有效结合DNA链与5-胞嘧啶甲基转移酶形成共价化合物,从而阻碍基因发生甲基化[9]。CpG甲基转移酶M.SssI可有效识别双链DNA上的二核苷酸序列,特异性模拟高等真核生物基因组甲基化修饰,甲基化所有胞嘧啶残基(未甲基化和半甲基化)[10]。本试验结果显示5-氮杂胞苷可显著性提高鸡RIPK2基因表达(或启动子活性),而M.SssI作用相反。研究结果表明鸡RIPK2基因的表达确实与DNA 甲基化状态有关,且受DNA甲基化抑制剂和CpG甲基化转移酶调控。因此,在细菌感染的实践中,通过DNA甲基化激活剂或抑制剂调节RIPK2基因的表达水平可以提高家禽免疫能力并控制过度炎症反应。
总之,LPS诱导可显著性影响鸡RIPK2基因甲基化状态。DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷可降低鸡RIPK2基因上游部分CpG位点甲基化水平,使其启动子区低甲基化,从而促进基因表达。而CpG甲基转移酶M.SssI使鸡RIPK2基因启动子区甲基化水平升高,抑制基因表达。研究结果对提高家禽免疫和控制过度性炎症反应具有十分重要的现实意义。
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