宋 辉，于艺冰，郭媛媛
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成年人白血病中最常见的一种，恶性程度高，病人5年生存率仅30%～40%[1]。深入探讨AML的发病机制并寻找潜在的分子生物学标志物有重要意义。乙酰化是表观遗传学研究的热点，乙酰基转移酶可以调节蛋白的乙酰化水平，进而影响蛋白降解。常见的乙酰基转移酶包括：GANT(Gcn5-related N-acetyltransferases)超家族、p300/CBP蛋白家族和MYST蛋白家族[2]。N-乙酰基转移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)是乙酰基转移酶GANT超家族成员之一，其最早被发现可作为人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因的转录激活子，NAT10与细胞增殖、侵袭、凋亡、上皮间质转化和衰老等有关[3]，在肝细胞癌、乳腺癌和结直肠癌等的发生和发展中起到重要作用[4-7]。由于乙酰基转移酶参与的表观遗传学修饰和白血病关系密切[8-9]，因此我们推测NAT10可能也参与了AML的发生和发展，然而既往少有相关报道。本研究探讨NAT10基因表达与AML预后的关系，现对结果作一报道。
1.1 一般资料 选取2015年9月至2018年1月我院收治的84例初治AML病人(初治组)、20例复发AML病人(复发组)和20例AML完全缓解病人(缓解组)，均符合2012年美国国家综合癌症网络制定的AML诊治指南[10]。另选取20名骨髓捐赠的健康人作为对照组。所有受试者均签署知情同意书。
表1 4组一般资料比较
1.2 RT-PCR检测骨髓单个核细胞中NAT10 mRNA的表达 取所有受试者骨髓5 mL，放置于EDTA抗凝管中，用等体积无菌0.9%氯化钠溶液进行稀释。随后用密度梯度离心法分离提取骨髓中单个核细胞，实验中所用的淋巴细胞分离液购于北京索莱宝公司。用TRIZOL试剂(武汉科昊佳生物科技有限公司)提取总RNA，随后用RNA逆转录试剂盒(美国THERMO FISHER公司)将RNA反转录为cDNA，总反应体系20 μL。接下来用SYBR Select Master Mix试剂盒(美国 Roche 公司)进行荧光定量PCR，反应体系为：2 μL 10×PCR缓冲液、1.1 μL 探针、0.5 μL cDNA、1 μL Taq酶、0.4 μL dNTP，加水至20 μL。反应条件：50 ℃ 120 s；
95 ℃ 120 s；
95 ℃ 15 s；
60 ℃ 60 s，共40个循环。用2-△△Ct法计算单个核细胞中NAT10 mRNA相对表达量。
1.3 治疗和随访 84例初治AML病人的治疗参考2012年美国国家综合癌症网络制定的AML诊治指南[10]。用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)或IA(去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)等标准方案进行诱导化疗，缓解后给予大剂量阿糖胞苷进行巩固治疗。随后根据病人经济及预后危险度进行维持治疗或者干细胞移植治疗等。病人出院后以门诊和电话方式进行随访，记录总生存时间：AML病人诊断之日起至末次随访或者死亡时间；
无事件生存时间：AML病人诊断之日起至死亡、骨髓未缓解、缓解后复发或者末次随访时间[11]。
1.4 统计学方法 采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验和χ2检验。采用ROC曲线分析NAT10 mRNA早期诊断AML的价值，计算曲线下面积(AUC)。生存预后的影响因素采用COX多因素分析，Kaplan-Meier法进行生存分析。
2.1 4组NAT10 mRNA表达水平比较 4组NAT10 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。初治组、复发组骨髓单个核细胞中NAT10 mRNA相对表达量均高于缓解组和对照组(P<0.05)(见表2)。
表2 4组NAT10 mRNA表达水平比较
2.2 NAT10 mRNA早期诊断AML的价值 NAT10 mRNA早期诊断AML的AUC为0.827(95%CI：0.723～0.930，P<0.01)，当NAT10 mRNA为4.88时约登指数0.662为最大，即此时诊断价值最高，灵敏度和特异度分别为83.6%和82.6%(见图1)。
2.3 NAT10 mRNA与AML临床病理特征的关系 以中位表达水平(5.15)将84例AML病人分为高表达组和低表达组，所有病人给予DA或IA诱导化疗，高表达组一个疗程完全缓解率为35.71%，低于低表达组的69.04%，差异有统计学意义(P<0.01)(见表3)。
表3 NAT10 mRNA高表达组和低表达组一般资料比较
2.4 影响AML病人总生存时间和无事件生存时间的单因素和logistic多因素分析 对84例AML病人进行了2～18个月的随访。单因素分析显示，FLT3-ITD/TKD突变和NAT10 mRNA高表达是AML病人总生存时间和无事件生存时间的影响因素(P<0.05)。COX多因素分析显示，FLT3-ITD/TKD突变和NAT10 mRNA高表达是AML病人总生存时间的独立影响因素(P<0.05)，另外，FLT3-ITD/TKD突变和NAT10 mRNA高表达也是AML病人无事件生存时间的独立影响因素(P<0.05)(见表4～5)。
表4 影响AML病人总生存时间和无事件生存时间的单因素分析[M(P25,P75)]
表5 AML病人总生存时间和无事件生存时间的COX多因素分析
2.5 Kaplan-Meier生存曲线分析NAT10 mRNA与AML病人生存预后的关系 NAT10 mRNA高表达组中位总生存时间为4个月，低于低表达组的10个月(χ2=10.00，P<0.01)。NAT10 mRNA高表达组中位无进展生存时间为3个月，低于低表达组的8个月(χ2=8.121，P<0.01)(见图2)。
AML是血液系统恶性肿瘤，其发病机制目前尚未完全明确，可能与电离辐射、化学物质、细胞毒物、病毒感染和遗传等有关[12]。探寻AML的发病机制及生物学标志物有重要临床意义。NAT10基因定位于11p13染色体上，相对分子质量约116 000。NAT10具有乙酰化转移酶作用，研究[13]证实其在端粒酶活性调控、核糖体RNA合成调控、染色体解聚调控和胞质分裂调控中发挥重要作用。NAT10与癌症、衰老密切相关[6,14-15]。
NAT10基因在人体各组织均有表达，当发生肿瘤时NAT10的定位和表达均发生了改变，进而影响肿瘤细胞的生物学行为[16]。TAN等[17]最早发现，NAT10可作用于细胞微管，影响卵巢癌细胞的增殖。在结肠癌的研究中发现，正常组织中NAT10主要定位于细胞核，而结肠癌组织中NAT10主要定位于细胞膜，NAT10可以通过调控糖原合成酶激酶3β影响结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移[18]。MA等[19]发现，与上皮型肝癌细胞比较，间充质肝癌细胞的NAT10表达水平较高，下调NAT10的表达后，两种肝癌细胞的上皮间质转换、侵袭、转移能力均明显下降。
NAT10与AML的关系既往少有报道，本研究发现，AML病人骨髓单个核细胞中NAT10 mRNA表达明显高于健康人，提示NAT10可能参与了AML的发生，另外本研究ROC曲线分析还发现NAT10对AML的早期诊断有一定价值，AUC为0.831。NAT10还与肿瘤的治疗相关，例如LIU等[6]发现，NAT10可以乙酰化MOCR2调节乳腺癌细胞周期检查点，影响癌细胞对放化疗的耐受性。本研究中，初治组骨髓单个核细胞中NAT10 mRNA相对表达量为(5.12±0.63)、复发组为(4.69±0.68)，均高于缓解组的(1.62±0.48)。以中位表达水平将84例AML病人分为高表达组和低表达组，所有病人给予DA或IA诱导化疗，高表达组一个疗程完全缓解率为35.71%，低表达组为69.05%，组间比较有统计学差异。说明NAT10可能有助于评估ANL的治疗效果。
AML预后的影响因素较多，包括年龄、染色体核型、基因突变和治疗方案等[20-21]。FLT3-ITD/TKD突变是AML中最常见的突变类型，与病人近期和远期预后密切相关，本研究结果与既往报道[22]一致。亦有研究发现，NAT10与鼻腔鼻窦黏膜黑素瘤的淋巴结转移有关，NAT10高表达病人的3年和5年生存率较低[23]。本研究COX多因素分析和Kaplan-Meier生存曲线分析结果均显示，NAT10 mRNA与AML病人的生存预后有关，NAT10 mRNA表达水平越高，AML病人的总生存时间和无事件生存时间越低，提示NAT10 mRNA可能成为AML预后早期评估的指标。
综上，本研究发现初治和复发AML病人骨髓单个核细胞中NAT10 mRNA相对表达量明显高于AML缓解病人和健康人，提示NAT10对AML的早期诊断及病情评估可能有一定价值。另外，COX多因素分析和Kaplan-Meier生存曲线分析结果均显示，NAT10 mRNA高表达与AML病人的不良生存预后有关。本研究也存在一些局限性，例如样本量相对较小，因此没有根据FAB分型进行分层分析；
未检测AML病人血清中NAT10的表达水平；
对AML病人的随访时间相对较短。未来需要进一步探讨NAT10在AML中的作用及机制。